張智,谷瑋瑋,馬蘊(yùn)蕾,董宇杰,丁春華

(1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北保定　071000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心,河北石家　050017；3.河北省中醫(yī)院呼吸科,河北石家莊　050017；4.北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所病理科,北京　101149；5.河北醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，河北 石家莊　050017)

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褪黑素通過(guò)抑制P-選擇素表達(dá)減輕內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷

張智1,谷瑋瑋2,馬蘊(yùn)蕾3,董宇杰4,丁春華5

(1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北保定071000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心,河北石家050017；3.河北省中醫(yī)院呼吸科,河北石家莊050017；4.北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所病理科,北京101149；5.河北醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，河北 石家莊050017)

摘要：為探討P-選擇素(Ps)在內(nèi)毒素(LPS)致大鼠急性肺損傷(ALI)時(shí)肺組織中的表達(dá)及褪黑素(MT)對(duì)其表達(dá)的影響,將SD大鼠隨機(jī)分為3組,對(duì)照(Control)組、模型(LPS)組、褪黑素干預(yù)(MT+LPS)組,采用氣管內(nèi)滴注脂多糖(LPS)的方法建立大鼠ALI模型,光鏡下觀察大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變,采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot技術(shù)觀察肺組織中P-選擇素的表達(dá)變化.結(jié)果顯示：模型組較對(duì)照組肺組織損傷嚴(yán)重,P-選擇素的陽(yáng)性表達(dá)明顯增多(P<0.05)；應(yīng)用褪黑素干預(yù)后顯著緩解上述變化(P<0.05).這說(shuō)明褪黑素可能通過(guò)抑制P-選擇素的表達(dá)發(fā)揮對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用.

關(guān)鍵詞：褪黑素；急性肺損傷；P-選擇素；脂多糖

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是各種原因引起的肺泡上皮、肺微血管內(nèi)皮和肺間質(zhì)的急性彌漫性損傷,也是臨床上一種常見(jiàn)的危重病癥,預(yù)后差,死亡率高,但其發(fā)病機(jī)制至今未完全闡明[1].研究表明,P-選擇素(P-selectin,Ps)在炎癥反應(yīng)、血栓形成等多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,在ALI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色.褪黑素(melatonin,MT)是一種由松果體分泌的具有多種功能的神經(jīng)內(nèi)分泌激素,具有強(qiáng)烈的抗氧化應(yīng)激作用,可對(duì)ALI時(shí)的肺組織起到保護(hù)作用[2-3].但是,褪黑素抗炎抗氧化作用的機(jī)制到目前仍不清楚.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣管內(nèi)滴注脂多糖的方法復(fù)制急性肺損傷大鼠模型,觀察褪黑素抗急性肺損傷的作用,為褪黑素的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量200～240 g,由河北醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證編號(hào)：1005109.

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

褪黑素(美國(guó)Sigma公司),脂多糖(美國(guó)Sigma公司),山羊抗Ps多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),電子天平(AE240,日本METTLER公司),低溫離心機(jī)(EBA12R,德國(guó)Hettich公司),組織勻漿器(PT-MR2100,瑞士Kinematica公司),石蠟切片機(jī)(RM2235,德國(guó)Leica公司),免疫組化試劑盒(北京中杉生物工程公司).

1.3急性肺損傷模型的制備

24只大鼠隨機(jī)分為3組,每組8只.Control組：氣管內(nèi)滴注生理鹽水(200 μL/只)；LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS(200 μg/200 μL/只);MT + LPS 組：氣管內(nèi)滴注LPS(200 μg/200 μL/只),并在滴注前后30 min分別腹腔注射MT(10 mg/kg).各組大鼠于手術(shù)6 h后處死取材.

1.4檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1肺組織病理學(xué)改變

部分肺葉組織,采用40 g/L多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片,行蘇木素-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理學(xué)改變.

1.4.2肺組織中P-選擇素的表達(dá)變化

常規(guī)石蠟包埋切片,脫蠟水化,37 ℃山羊血清封閉30 min,一抗于37 ℃濕盒中孵育90 min,加入二抗,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片.P-選擇素陽(yáng)性表達(dá)于胞漿中,呈棕黃色顆粒,計(jì)算5個(gè)視野平均光密度(OD)的均值來(lái)代表該切片的OD值.

1.4.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)P-選擇素表達(dá)水平

處死動(dòng)物取新鮮肺組織約50 mg,進(jìn)行總RNA提取(Trizol法),用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度：分光光度計(jì)測(cè)定260 nm及280 nm處OD值,OD260/OD280值在1.8～2.0內(nèi)純度較好.取總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)體系為：總RNA模板1 μg,Oligod(T)12-18Primer(10 μmol)2 μL,dNTP Mix(10 mmol total)2 μL,5× First-Strand Buffer 4 μL,RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL,TIANScript M-MLV(200 U)1 μL,加DEPC水至20 μL,混勻各管,37 ℃ 5 min；42 ℃ 1 h；95 ℃ 5 min.反應(yīng)結(jié)束后,置冰上冷卻,取1 μL cDNA用于做PCR,剩余-80 ℃保存.用于擴(kuò)增P-選擇素的引物序列如下：

上游引物：5-CCAATGTGTGAAGCCATCAA-3

下游引物：5-GACACTGTGCACTCCACATT-3,長(zhǎng)度為164 bp.

以GAPDH做為內(nèi)參,其引物序列為

上游引物：5-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3

下游引物：5-AGATCCACAACGGATACATT-3,長(zhǎng)度為307 bp.

反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL,上游引物(20 μmol)0.25 μL,下游引物(20 μmol)0.25 μL,Taq酶 Mix(5 U/μL)5 μL,滅菌超純水至10 μL,擴(kuò)增程序?yàn)椋?)94 ℃,5 min；2)94 ℃,45 s；58～62 ℃,45 s；72 ℃,45 s；35個(gè)循環(huán)(退火溫度根據(jù)不同引物調(diào)整)；3)72 ℃,10 min.反應(yīng)完畢后取PCR產(chǎn)物5 μL，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在凝膠成像儀成像并進(jìn)行灰度掃描分析.

1.4.4Western blot 技術(shù)檢測(cè)肺組織P-選擇素蛋白表達(dá)的變化

冰浴下制備100 g/L肺組織勻漿,采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量.加入2×SDS加樣緩沖液煮沸10 min,質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉,加入一抗,4 ℃靜置過(guò)夜.加入相應(yīng)二抗,37 ℃ 1 h,DAB顯色.采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析.

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1光鏡下肺組織形態(tài)學(xué)改變

Control組肺組織清晰、完整,肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出液；LPS組肺組織損傷嚴(yán)重,肺泡間隔增寬,肺泡腔出血,間質(zhì)內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；MT+LPS組上述病變明顯減輕(圖1).

a.Control 組;b.PS組;c.MT+LPS 組.圖1　各組大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE染色,×400倍)Fig.1　Light micrographs of lung tissue structure (HE×400)

2.2肺組織P-選擇素免疫組化結(jié)果

Control組P-選擇素陽(yáng)性信號(hào)較弱；LPS組的陽(yáng)性信號(hào)明顯增強(qiáng),主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞；MT+LPS組較與LPS組陽(yáng)性信號(hào)減弱(P<0.05,圖2,表1).

a.Control 組;b.LPS組;c.MT+LPS 組.圖2　各組大鼠肺組織P-選擇素免疫組化表達(dá)結(jié)果(×400)Fig.2　Immunohistochemical micrographs of P-selectin expression in lung tissue(SP×400)

組別 OD值 Control組0.13±0.04LPS組0.36±0.07*MT+LPS組0.27±0.05#

*與Control 組相比P<0.05;#與LPS 組相比P<0.05.

2.3RT-PCR檢測(cè)Ps mRNA表達(dá)結(jié)果

應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)Ps mRNA表達(dá)量的變化,Ps mRNA大小為164 bp,內(nèi)參GAPDH為307 bp.結(jié)果顯示,LPS組Ps mRNA表達(dá)水平與內(nèi)參GAPDH比值(0.7325±0.1894)較Control組Ps mRNA表達(dá)水平與內(nèi)參GAPDH比值(0.300 4±0.054 9)明顯升高,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示顯著性差異(P<0.05).給予MT治療后,Ps mRNA表達(dá)與內(nèi)參GAPDH比值(0.502 5±0.127 3)減少,統(tǒng)計(jì)結(jié)果與LPS組比較顯示顯著性差異(P<0.05),但Ps mRNA表達(dá)水平仍高于Control組(圖3,4).

*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs LPS group. 圖3　各組大鼠肺組織Ps mRNA表達(dá)結(jié)果 圖4　各組大鼠肺組織Ps mRNA/GAPDH比值Fig.3　mRNA level of P-selectin in Control group,LPS Fig.4　Level of Ps mRNA/GAPDH in Control group,group,and MT+LPS groupLPS group,and MT+LPS group

2.4肺組織Western blot檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)Ps表達(dá)量的變化,目的蛋白Ps分子質(zhì)量為140 ku；內(nèi)參β-actin分子質(zhì)量42～43 ku.以內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)量為參考標(biāo)準(zhǔn),LPS組肺組織中Ps蛋白表達(dá)(0.718 1±0.074 2)與Control組(0.228 4±0.058 6)相比,明顯增多(P<0.05)；給予MT治療后Ps蛋白表達(dá)(0.483 7±0.013 3)與LPS組相比表達(dá)量減小，但仍高于Control組(P<0.05,圖5,6).

*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs LPS group. 圖5　各組大鼠肺組織Western blot檢測(cè)結(jié)果 圖6　各組大鼠肺組織 P-selectin/β-actin比值　Fig.5　Result of P-selectin and β-actin expression in the Fig.6　Protein level of P-selectin/β-actin in Control group,

3討論

急性肺損傷(ALI)是由于心源性以外的各種肺內(nèi)、肺外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭,ALI 的嚴(yán)重階段即急性呼吸窘迫綜合征(ARDS).本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣管內(nèi)滴注LPS,病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺泡間隔增寬,肺泡腔出血,間質(zhì)內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),提示成功建立了ALI的動(dòng)物模型.

正常情況下,P-選擇素(Ps)儲(chǔ)存在靜止血小板顆粒及內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-palade bodies 中.在氧自由基、組胺等炎性介質(zhì)的刺激作用下,血小板和內(nèi)皮細(xì)胞被激活發(fā)生脫顆粒反應(yīng),P-選擇素轉(zhuǎn)移至胞膜表面,與表達(dá)于中性粒細(xì)胞等細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合,介導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附、活化,同時(shí)釋放炎性遞質(zhì)[4-6].研究顯示：通過(guò)抑制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織Ps的表達(dá),可以有效減輕炎癥反應(yīng)[7]；降低肺血栓栓塞時(shí) Ps 表達(dá),可以減輕炎癥和凝血纖溶失衡對(duì)肺組織的損害[8].

褪黑素(MT)是由松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素,具有抗氧化應(yīng)激、清除自由基、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、抗腫瘤等多種功能.MT可以通過(guò)直接清除氧自由基、提高抗氧化酶的活性、減少自由基生成等方面發(fā)揮抗氧化作用[9].本室以往研究[10]發(fā)現(xiàn),MT可以有效減輕ALI時(shí)肺組織的炎癥反應(yīng).為了進(jìn)一步研究MT對(duì)ALI大鼠的保護(hù)作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)觀察了MT對(duì)肺組織Ps表達(dá)的影響.免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR和Western blot結(jié)果均表明MT能明顯降低肺組織Ps的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng).

ALI發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今尚未完全闡明.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示褪黑素可能通過(guò)抑制P-選擇素的表達(dá),發(fā)揮對(duì)ALI時(shí)肺組織的保護(hù)作用.至于褪黑素通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)ALI的炎癥過(guò)程,還有待于進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Melatonin inhibited P-selectin expression on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in rats

ZHANG Zhi1,GU Weiwei2,MA Yunlei3,DONG Yujie4,DING Chunhua5

(1.College of Basic Medical Science,Hebei University,Baoding 071000,China;2.Experiment Center,The Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;3.Department of Respiration,Traditional Chinese Medicine Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050017,China;4.Department of Pathology,Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute,Beijing 101149,China;5.Department of Pathophysiology,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)

Abstract:To observe the expression of P-selectin(Ps) in lung tissues of acute lung injury(ALI) rat model induced by lipopolysaccharide(LPS) and examine the effect of melatonin(MT) to its expression all rats were randomly divided into three groups:Control group,LPS group and MT+LPS group.Lung tissues were imbedded by paraffin to observe morphological changes.The auther used immunohistochemical staining technique,reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blot method to detect the expression of P-selectin.The results showed that compared with Control group,alveolar septum thickened significantly in LPS group,positive expression of P-selectin was very obvious(P<0.05);the administration of MT mitigated above changed significantly(P<0.05).The results suggested that MT possessed obvious protective effect on lung tissues during ALI,its protective mechanism might be related to the inhibition of the expression of P-selectin.

Key words:melatonin;acute lung injury;Ps;LPS

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.013

收稿日期：2015-03-12

基金項(xiàng)目：河北省科技廳資助項(xiàng)目(08276101D-88)

通信作者：丁春華(1954—),女,河北保定人,河北醫(yī)科大學(xué)教授,主要從事急性肺損傷研究.E-mail：dcp4@sina.com

中圖分類號(hào)：R96

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-1565(2016)01-0078-06

第一作者：張智(1982—),男,河北衡水人,河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)師,主要從事病理學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究.E-mail：zhzp13@163.com