劉蒲臨 程德勇 繆禮鴻

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023）

產(chǎn)幾丁質(zhì)酶?jìng)?cè)孢短芽孢桿菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究

劉蒲臨 程德勇 繆禮鴻

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023）

篩選并鑒定高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的芽孢桿菌菌株，旨在研究其酶學(xué)特性為高效利用幾丁質(zhì)酶資源奠定基礎(chǔ)。分離純化產(chǎn)幾丁質(zhì)酶芽孢桿菌，將目的菌株的幾丁質(zhì)酶基因異源表達(dá)并純化后研究其酶學(xué)參數(shù)?？紤]到菌株的生物安全性，選擇側(cè)孢短芽孢桿菌CDY64為進(jìn)一步研究對(duì)象，將其幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)于大腸桿菌BL21中。酶學(xué)研究表明，純化后的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為60℃，在pH6.0-8.0范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的活性；使用膠體幾丁質(zhì)作為底物時(shí)Km與kcat值分別為5.85 μmol/L和29.27 S-1。結(jié)果表明，側(cè)孢短芽孢桿菌CDY64所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶在高溫下具有良好的催化能力，在體外對(duì)多種植物病原真菌表現(xiàn)出了良好的拮抗作用。

幾丁質(zhì)酶；側(cè)孢短芽孢桿菌；酶學(xué)性質(zhì)

幾丁質(zhì)酶可以催化幾丁質(zhì)的水解，廣泛存在于高等動(dòng)植物、微生物以及某些病毒體內(nèi)［1］。自Skujins等［2］首次發(fā)現(xiàn)來(lái)源于鏈霉菌（Streptomyces）的幾丁質(zhì)酶可以分解黑曲霉（Aspergillus niger）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）的細(xì)胞壁以來(lái)，利用幾丁質(zhì)酶來(lái)防治植物真菌病害已經(jīng)成為最主要的應(yīng)用研究領(lǐng)域。幾丁質(zhì)酶和產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的菌株除了可以單獨(dú)用于植物病蟲害防治以外，也可以通過(guò)和其他抗生素與殺蟲劑共同使用來(lái)減少其他化學(xué)試劑的用量，進(jìn)而減少對(duì)環(huán)境和人類健康的危害。已有研究表明將內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白同時(shí)使用可以將δ-毒素的殺蟲效力提高近10倍［3，4］。此外，由于幾丁質(zhì)降解所得到的幾丁寡糖具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫力和抗癌等功能，其在功能食品和保健藥品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，幾丁六糖和幾丁七糖已被證明具有良好的抗腫瘤活性［5，6］。與其他方法相比，幾丁質(zhì)酶解產(chǎn)生幾丁寡糖的方法具有反應(yīng)專一性強(qiáng)，不會(huì)引起結(jié)構(gòu)破壞，副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。因此利用幾丁質(zhì)酶來(lái)生產(chǎn)幾丁寡糖也成為幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用研究領(lǐng)域之一。

本研究以獲得產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的芽孢桿菌出發(fā)，從土壤中分離出7株菌株。經(jīng)過(guò)比較分析后篩選出一株側(cè)孢短芽孢桿菌，將其幾丁質(zhì)酶基因克隆表達(dá)于大腸桿菌中，并通過(guò)對(duì)該幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，旨在為幾丁質(zhì)酶制劑的開發(fā)和廢棄幾丁質(zhì)資源的有效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物病原真菌 尖孢鐮刀菌（F. oxysporum ACCC209139）， 禾 谷 絲 核 菌（Rhizoctonia solani CICC40529）和腐皮鐮刀菌（F. solani CICC2603），分別購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）和中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離純化培養(yǎng)基（g/L）：膠體幾丁質(zhì) 7.0，酵母提取物 2.0，KH2PO43.0，K2HPO42.0，NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，瓊脂 15。酶活測(cè)定培養(yǎng)基：分離純化培養(yǎng)基不添加瓊脂。細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。大腸桿菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。病原真菌培養(yǎng)與拮抗能力檢測(cè)培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基［7］均于1.01×105Pa滅菌30 min后使用。

1.2 方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的制備 將30 g幾丁質(zhì)粉末（Sigma-Aldrich，USA）緩慢加入至300 mL預(yù)冷的濃鹽酸中，磁力攪拌2 h后放入4℃靜置24 h。然后將該混合液緩慢加入至2 L預(yù)冷的蒸餾水中攪拌均勻。5 000 ×g離心10 min收集白色的膠體幾丁質(zhì)沉淀，反復(fù)沖洗至pH約為6.5。最后用500 mL蒸餾水重懸，即獲得濃度為6%的膠體幾丁質(zhì)母液。

1.2.2 菌株的篩選 土壤樣品為棉田和菜園土壤，采自于湖北武漢市周邊。采集土壤樣品后，取10.0 g土樣加入90 mL無(wú)菌水中制備土壤懸液。經(jīng)過(guò)80℃處理20 min后梯度稀釋。將稀釋液涂布在分離培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)。待菌落周圍出現(xiàn)透明圈后反復(fù)劃線分離，得到純培養(yǎng)。

1.2.3 菌種的16S rRNA基因序列測(cè)定 將菌株接種至液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)期后使用TIANamp細(xì)菌基因組抽提試劑盒（Tiangen Biotech，China）抽提獲得基因組DNA。采用通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后TA克隆至載體pMD18-T中測(cè)序。將測(cè)序所得序列提交至GenBank中。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定 使用DNS法［8］（3，5-二硝基水楊酸比色法），以β-D-N-乙酰氨基葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對(duì)待測(cè)樣品以及樣品空白進(jìn)行測(cè)定。將每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

1.2.5 拮抗病原真菌能力的測(cè)定 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法［9］：分別將尖孢鐮刀菌，禾谷絲核菌和腐皮鐮刀菌培養(yǎng)2-3 d，然后從菌落邊緣取下直徑5 mm大小的菌餅置于新的PDA平板中央。使用打孔器取下濾紙片，然后將濾紙片貼至距中央3 cm處。定量滴加菌懸液（或酶溶液）后，置于30℃培養(yǎng)并觀察抑菌情況。培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落半徑和抑菌圈半徑（x-±s），分別用D和H來(lái)表示。根據(jù)抑菌圈半徑和菌苔半徑的比值大小判斷菌株（或幾丁質(zhì)酶）的抑菌能力。

1.2.6 幾丁質(zhì)酶基因的克隆與異源表達(dá) 根據(jù)側(cè)孢短芽孢桿菌DSM25和GI9全基因組序列信息設(shè)計(jì)兼并引物，以菌株CDY64總基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到除信號(hào)肽之外的ORF片段，引物序列見(jiàn)表1。將得到的不含信號(hào)肽的ORF片段通過(guò)Sac I和Xho I酶切后，連接進(jìn)入表達(dá)載體pET28a中。將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR以及酶切驗(yàn)證后，所得到的正確的重組質(zhì)粒命名為pETChi72A。

表1 本研究所使用的引物序列

1.2.7 幾丁質(zhì)酶的分離純化 將重組質(zhì)粒pETChi72A轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli BL21（DE3）中。篩選轉(zhuǎn)化子后使用液體LB過(guò)夜培養(yǎng)獲得種子液，然后以1%接種量接種至新的LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/mL硫酸卡那霉素），37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600達(dá)到0.4時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG。然后28℃培養(yǎng)8 h誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)。由于重組蛋白N端含有六聚組氨酸標(biāo)簽，因此使用Ni-瓊脂糖蛋白純化試劑盒（Tiandz，China）對(duì)異源表達(dá)的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行純化。菌體的高壓破碎、蛋白上樣與洗脫均參照試劑盒手冊(cè)進(jìn)行。使用葡聚糖凝膠除鹽后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)是否得到純化的幾丁質(zhì)酶。所獲得的幾丁質(zhì)酶溶液經(jīng)過(guò)Bradford法［10］定量后用于酶學(xué)特性研究。

1.2.8 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定 最適溫度和pH值的測(cè)定：分別于20-80℃以及pH為3.0-10.0條件下測(cè)定Chi72A的活性，并以相對(duì)酶活的百分比為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖。

熱穩(wěn)定性的測(cè)定：將Chi72A置于20-80℃下水浴3 h后檢測(cè)酶活，并以相對(duì)酶活的百分比為縱坐標(biāo)，以溫度為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖。

酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定：在幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)條件下，使用純酶液與不同濃度的膠體幾丁質(zhì)（1-25 mg/mL）反應(yīng)，測(cè)定其酶促反應(yīng)的初始速度。通過(guò)雙倒數(shù)法作圖確定Km和Vmax值。幾丁質(zhì)酶的催化常數(shù)由方程kcat= Vmax/［E］計(jì)算得出，［E］代表幾丁質(zhì)酶的濃度。

金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活的影響：向酶促反應(yīng)體系中分別加入Mg2+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+和Cu2+共6種金屬離子至終濃度為10 mmol/L。定量測(cè)定不同金屬離子對(duì)Chi72A酶活的影響。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶芽孢桿菌的分離

使用平板計(jì)數(shù)法對(duì)不同土壤樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)不同土壤樣品的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)介于0.8×108-3.3×108cfu/g之間。與此同時(shí)，將不同土壤懸液80℃處理20 min后，涂布至以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的篩選平板上。28℃培養(yǎng)3-7 d后，有多種細(xì)菌菌落產(chǎn)生水解圈。能分泌幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生水解圈的菌落數(shù)量平均占可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的1.4%。本實(shí)驗(yàn)共篩選純化得到7個(gè)不同菌株。

2.2 菌株產(chǎn)酶能力與拮抗病原真菌能力的測(cè)定

將上述菌株接種至100 mL酶活測(cè)定培養(yǎng)基中，使用搖瓶發(fā)酵的方法分別在12、24、36和48 h取樣測(cè)定不同菌株的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力。來(lái)源于菜園土壤的菌株（Paenibacillus sp. W1，Paenibacillus sp. A14，Br. laterosporus CDY64和 Brevibacillus sp. CDY118）平均酶活較高，其中CDY118酶活最高達(dá)到63.7 U/L；而來(lái)源于棉田的菌株（Paenibacillus sp. H316，B. aryabhattai H2-16和 Brevibacillus sp. L2）平均酶活較低，菌株H316整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)所測(cè)得的最高酶活僅為24.3 U/L。不同菌株的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力如表2所示

表2 不同菌株在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)的酶活變化

表3 不同菌株對(duì)尖刀鐮孢菌的拮抗能力

不同菌株拮抗尖孢鐮刀菌的能力如表3所示。所有被試菌株均表現(xiàn)出了對(duì)植物病原真菌的拮抗性能。

2.3 側(cè)孢短芽孢桿菌中幾丁質(zhì)酶基因克隆與分析

使用菌株CDY64的基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)的幾丁質(zhì)酶基因（chi72A，KT205398）。經(jīng)過(guò)TA克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，chi72A全長(zhǎng)為1 950 bp，所編碼蛋白質(zhì)分子量為72.23 kD。對(duì)該基因所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析后發(fā)現(xiàn)，該幾丁質(zhì)酶存在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為N端催化結(jié)構(gòu)域和C端的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。由于Chi72A的活性中心（F169EGIDIDYE177）與PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)中第18糖苷酶家族活性中心的氨基酸序列（［LIVMFY］-［DN］-G-［LIVMF］-［DN］-［LIVMF］-［DN］-x-E）一致，因此可以判斷該幾丁質(zhì)酶屬于第18糖苷酶家族。多序列比對(duì)結(jié)果（圖1）表明，Chi72A催化區(qū)域的氨基酸序列與側(cè)孢短芽孢桿菌DSM25所編碼的幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)出了97.4%的相似性；與蠟狀芽孢桿菌ATCC4342的幾丁質(zhì)酶ChiC，環(huán)狀芽孢桿菌WL-12的幾丁質(zhì)酶ChiA1以及粘質(zhì)沙雷氏菌2170的幾丁質(zhì)酶ChiA的序列相似性分別為49%、51%和40%。

此外，多序列比對(duì)還發(fā)現(xiàn)，Chi72A的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域除了與其他幾種細(xì)菌幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)出序列相似性以外，還與鏈霉菌所編碼的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出了較高的序列相似性。

圖1 幾丁質(zhì)酶Chi72A催化區(qū)域的多序列比對(duì)圖譜

圖2 Chi72A純化后的SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖譜

2.4 異源表達(dá)幾丁質(zhì)酶的純化

為了進(jìn)一步研究Chi72A的酶學(xué)特性與影響因素，將除信號(hào)肽以外的ORF序列酶切后連接進(jìn)入表達(dá)載體pET28a中。重組菌株使用0.1 mmol/L IPTG，28℃誘導(dǎo)8 h后，使用高壓破碎儀進(jìn)行破碎。然后12 000 ×g離心10 min取上清。最后使用Ni-瓊脂糖和葡聚糖凝膠進(jìn)行分離純化。所獲得純品幾丁質(zhì)酶的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

2.5 Chi72A對(duì)病原真菌拮抗能力的檢測(cè)

將純化后的幾丁質(zhì)酶溶液50 μL緩慢滴加至濾紙片上，30℃培養(yǎng)3 d后觀察抑菌情況。結(jié)果（圖3）顯示，該幾丁質(zhì)酶除對(duì)尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出了很強(qiáng)的拮抗能力以外，還顯著抑制了禾谷絲核菌以及腐皮鐮刀菌的生長(zhǎng)。這也進(jìn)一步證實(shí)，該幾丁質(zhì)酶為菌株CDY64產(chǎn)生真菌拮抗能力的重要原因之一。

圖3 Chi72A對(duì)植物病原真菌拮抗作用的示意圖

2.6 溫度與pH對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

溫度與pH值對(duì)純化后Chi72A的影響如圖4所示。Chi72A在pH為6.0-8.0的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定；當(dāng)反應(yīng)緩沖液pH分別為3.0與10.0時(shí)，Chi72A酶活力分別下降至最高值的15%和27%（圖4-A）。圖4-B表明，Chi72A的最適反應(yīng)溫度為60℃。當(dāng)溫度為20℃時(shí)，Chi72A的酶活為最高值的23%；而當(dāng)反應(yīng)溫度為80℃時(shí)，Chi72A酶活僅為最高值的18%。為了進(jìn)一步研究Chi72A對(duì)高溫的耐受能力，將酶溶液分別置于20-80℃預(yù)處理3 h，然后在60℃以及pH=8.0的條件下測(cè)定酶溶液的殘余酶活力。圖4-C表明，Chi72A在50℃條件下處理3 h后，其酶活力沒(méi)有受到顯著影響。而當(dāng)預(yù)處理溫度提高至60℃時(shí)，其酶活力僅下降9%，具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

2.7 金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

金屬離子往往有助于維持酶的三維結(jié)構(gòu)，甚至直接參與酶的催化過(guò)程。因此，本研究分別檢測(cè)了Mg2+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+和Cu2+，6種金屬離子對(duì)純化后Chi72A酶活力的影響。結(jié)果（表4）顯示，當(dāng)向反應(yīng)液中添加CaCl2至終濃度為10 mmol/L時(shí)，Chi72A催化活性升高了10.5%；Fe3+和Cu2+對(duì)Chi72A表現(xiàn)出了抑制能力；尤其是添加Cu2+至終濃度為10 mmol/L時(shí)，Chi72A的活性下降了49%；而Mg2+、K+和Fe2+對(duì)Chi72A的酶活力沒(méi)有顯著影響。

圖4 Chi72A的酶學(xué)特性研究

表4 不同金屬離子對(duì)Chi72A酶活的影響

2.8 幾丁質(zhì)酶酶學(xué)參數(shù)的測(cè)定

分別用不同濃度的膠體幾丁質(zhì)（1-25 mg/mL），在最適反應(yīng)條件下對(duì)純化后Chi72A的起始反應(yīng)速度進(jìn)行測(cè)定。以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，獲得酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果（圖5）表明，Chi72A的Km值為5.85 μmol/L，而其催化常數(shù)，kcat為29.27 S-1（即每秒鐘可以產(chǎn)生相當(dāng)于29.27個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖的還原性末端）。

圖5 Chi72A酶促反應(yīng)的Lineweaver-Burk圖譜

3 討論

具有幾丁質(zhì)降解能力的細(xì)菌在自然界碳/氮循環(huán)過(guò)程中具有非常重要的作用。此類菌株以及相關(guān)降解基因的分離也有助于幾丁質(zhì)酶在工農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)所篩選菌株以膠體幾丁質(zhì)作為底物時(shí)，培養(yǎng)液中的幾丁質(zhì)酶的酶活力介于24.3 U/L和63.7 U/L之間，這與Trivedi等［11］所篩選的菌株酶活相似。由于側(cè)孢短芽孢桿菌在微生物肥料安全通用技術(shù)準(zhǔn)則（NY1009-2006）和農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼料添加劑目錄（2013）》中均屬于生物安全菌種，同時(shí)側(cè)孢短芽孢桿菌 CDY64又具有較高的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力以及拮抗病原真菌的能力，因此本研究以CDY64為目的菌株，對(duì)其所編碼的幾丁質(zhì)酶展開進(jìn)一步研究。

側(cè)孢短芽孢桿菌往往存在于多種水體、土壤或某些昆蟲的體表，能夠產(chǎn)生多種與殺蟲和拮抗病原真菌有關(guān)的蛋白質(zhì)和抗生素［12］。然而，側(cè)孢短芽孢桿菌中幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)和酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)尚未有報(bào)道。大多數(shù)細(xì)菌所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶屬于第18糖苷酶家族，而第18糖苷酶家族的幾丁質(zhì)酶又可以分為A、B和C三個(gè)亞類［13］。根據(jù)氨基酸序列相似性，Chi72A可歸類于A亞類。酶學(xué)特性研究表明Chi72A的最適反應(yīng)pH范圍為6.0-8.0，與地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）SK-1［14］所編碼的幾丁質(zhì)酶類似。迄今為止，大多數(shù)幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH值介于4.0-10.0之間，只有少部分幾丁質(zhì)酶的最佳pH超出這一范圍。例如，Pradeep等［15］發(fā)現(xiàn)一株鏈霉菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適pH值為12.5。由于高溫酶促催化過(guò)程有助于降低污染風(fēng)險(xiǎn)以及提高酶促反應(yīng)的速率，因此很多工業(yè)上的酶促反應(yīng)是在高溫下進(jìn)行的。本研究中所涉及的幾丁質(zhì)酶Chi72A具有良好的熱穩(wěn)定性，這將有助于該酶在幾丁質(zhì)廢棄物生物轉(zhuǎn)化方面的推廣與應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究在不同土壤樣品中共分離得到7株不同的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株，16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株可歸類于類芽孢桿菌、短芽孢桿菌和芽孢桿菌3個(gè)屬。酶學(xué)研究表明，側(cè)孢芽孢桿菌CDY64所編碼的幾丁質(zhì)酶（Chi72A）具有良好的熱穩(wěn)定性，其最佳反應(yīng)溫度為60℃；而且在50℃條件下預(yù)處理3 h沒(méi)有造成顯著的酶活喪失。此外，該幾丁質(zhì)酶在體外對(duì)多種植物病原真菌具有拮抗作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation of a Chitinase-producing Strain Brevibacillus laterosporus and Its Enzymatic Properties

LIU Pu-lin CHENG De-yong MIAO Li-hong
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023）

This study aims to screen and identify Bacillus strain producing high yield of chitinase and to study its enzymatic properties for laying groundwork in the efficient utilization of chitinase resources. Firstly，the Bacillus producing chitinase was isolated and purified，and then chitinase gene in the target strain was heterologously expressed，and enzymatic parameters of the purified chitinase were assayed at optimal conditions. Considering the bio-safety of the strain，Brevibacillus laterosporus CDY64 was selected as study object，and its chitinase（Chi72A）was expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. Enzymatic studies revealed that the purified Chi72A by Ni-NTA affinity presented solid activity at pH range 6.0-8.0，and the optimal temperature of its activity was 60℃；and the Km and kcatof Chi72A were 5.85 μmol/L and 29.27 S-1，respectively while using colloidal chitin as substrate. In conclusion，Chi72A from CDY64 had high catalytic ability at high temperature and exhibited high antifungal activity against many phytopathogenic fungi in vitro.

chitinase；Brevibacillus laterosporus；enzymatic properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.025

2015-09-24

國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA10280），武漢輕工大學(xué)科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)（2014RZ19）

劉蒲臨，男，博士，研究方向：環(huán)境微生物學(xué)；E-mail：liunan3585@163.com

繆禮鴻，男，博士，研究方向：資源與環(huán)境微生物學(xué)；E-mail：miaowhpu@126.com