胡文哲 譚澤文 王勇 徐羨微 譚志遠(yuǎn)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642）

藤縣藥用野生稻內(nèi)生固氮菌分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

胡文哲 譚澤文 王勇 徐羨微 譚志遠(yuǎn)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642）

從廣西梧州市藤縣藥用野生稻中篩選內(nèi)生固氮菌，為微生物肥料生產(chǎn)收集菌種資源。采用3種無氮培養(yǎng)基經(jīng)平板劃線法篩選內(nèi)生固氮菌；通過乙炔還原法測定其固氮酶活性；利用IS-PCR（Insertion sequence-based PCR）指紋圖譜和全細(xì)胞蛋白電泳圖譜對獲得的內(nèi)生固氮菌進(jìn)行聚類分析；根據(jù)16S rRNA基因序列分析確定其進(jìn)化關(guān)系；使用分光光度計(jì)比色法檢測其產(chǎn)生長素能力、產(chǎn)鐵載體能力、溶磷能力和ACC脫氨酶活性。結(jié)果顯示，從野生稻中篩選獲得34株內(nèi)生固氮菌分為5個(gè)類群，類群I和II各有8株，類群III、IV、V分別有2株、5株和11株，其固氮酶活性介于5.0和1 036.7 nmol/（mL·h）之間。類群I代表菌株HU33與無乳固氮螺菌（Azospirillum amazonense ATCC 35119T）相似性為97.13%；類群II代表菌株HU31與變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola DSM 15968T）相似性為99.71%；類群III代表菌株HU17與蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii ATCC 700476T）相似性為99.86%；類群IV代表菌株HU13與黃黃色桿菌（Xanthobacter flavus ATCC 35867T）相似性為100%；類群V代表菌株CM05與越南伯克霍爾德菌（Burkholderia vietnamiensis LMG 10929T）相似性為99.86%。藥用野生稻內(nèi)生固氮菌資源具有遺傳多樣性；有些菌株有較強(qiáng)的產(chǎn)生長素、產(chǎn)鐵載體、ACC脫氨酶活性和溶磷能力，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用潛力；類群I可能是一個(gè)新類群。

藥用野生稻；內(nèi)生固氮菌；系統(tǒng)發(fā)育分析；全細(xì)胞蛋白電泳；IS-PCR

藥用野生稻是原產(chǎn)中國的3種野生稻之一，由于長期生長在惡劣的自然條件下，藥用野生稻經(jīng)受了各種自然災(zāi)害和不良環(huán)境的自然選擇，是一種很稀缺和重要的野生稻種質(zhì)資源，具有極高的科學(xué)研究價(jià)值［1］。

氮素是植物需求量最大的營養(yǎng)元素，長期大量單一施用化肥會造成肥料利用率低、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降和環(huán)境污染，生物固氮可以為農(nóng)作物提供氮素，與化肥相比不會降低土壤生產(chǎn)力、不污染環(huán)境，還是取之不盡、用之不竭的廉價(jià)氮源［2］。

植物內(nèi)生固氮菌是指那些定殖在健康植物體內(nèi)，與宿主植物進(jìn)行聯(lián)合固氮的一類微生物［3］。人們最早發(fā)現(xiàn)于1986年從巴西的甘蔗中分離得到內(nèi)生固氮菌，迄今不到30年［4］。內(nèi)生固氮菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組分，可以通過固氮作用、產(chǎn)生生理活性物質(zhì)、抗逆境、抗動物攝食和拮抗病原菌等作用從而促進(jìn)宿主對環(huán)境的適應(yīng)［5］。研究表明某些內(nèi)生固氮菌具有促進(jìn)植物生長、提高作物產(chǎn)量、生物防治等作用。Glick等［6］研究表明植物根際促生菌可產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶，該酶通過催化乙烯的前體ACC分解成α-丁酮酸和氨來降低植物體內(nèi)乙烯的合成，從而減少過量乙烯對植物生長造成的不利影響。王桂文等［7］研究認(rèn)為內(nèi)生固氮菌對植物的促生作用主要是通過生物固氮為植物提供氮營養(yǎng)或合成某些植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如生長素、赤霉素。還有研究表明鐵載體在植物根際促生菌對土傳病害的生防有重要作用，田方等［8］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)鐵載體菌株可與根際病原微生物爭奪有限鐵營養(yǎng)而抑制病原微生物生長。還有研究表明某些內(nèi)生固氮菌有強(qiáng)大的溶磷功能，通過分泌物或吸收作用把土壤中無效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為植物可以利用的有效態(tài)磷［9］。國內(nèi)外對很多禾本科植物內(nèi)生固氮菌的研究非常多，但是對生長于自然生態(tài)環(huán)境的藥用野生稻內(nèi)生固氮菌研究并不多。

本研究采用3種選擇性無氮培養(yǎng)基從廣西藤縣藥用野生稻中分離得到34株內(nèi)生固氮菌，通過ISPCR指紋圖譜和全細(xì)胞蛋白電泳對所分離的內(nèi)生固氮菌進(jìn)行聚類分析。根據(jù)每個(gè)類群代表菌株的生理生化鑒定和16S rRNA基因序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，旨在豐富內(nèi)生固氮菌的菌種資源庫和挖掘其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的潛在應(yīng)用價(jià)值，為微生物肥料生產(chǎn)收集菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用野生稻采集于廣西梧州市藤縣蒙江鎮(zhèn)那塘村一處山洼。

采用D?bereiner改良無氮培養(yǎng)基［10］（簡稱DN）、NFb無氮培養(yǎng)基［10］和CCM低氮培養(yǎng)基［11］3種選擇培養(yǎng)基進(jìn)行固氮菌的分離與篩選，VMEthanol培養(yǎng)基［10］進(jìn)行富集培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化和固氮酶活性測定 消毒：將野生稻的根、莖、葉沖洗干凈后，切成3 cm左右小段放入滅菌培養(yǎng)皿中，先用70%乙醇浸泡3 min，再用0.1% HgCl2表面消毒3 min，最后用無菌水振蕩洗滌5-7次，每次5 min，取最后一次洗滌液涂布LB平板，以檢查消毒是否徹底。

分離純化：將消毒后的根、莖、葉用滅菌剪刀剪碎，分別接種到3種半固體無氮培養(yǎng)基中用反口膠塞密封，37℃培養(yǎng)72 h后向試管中注射1/10體積10%乙炔（使其終濃度為1%）再培養(yǎng)24 h，用氣相色譜儀檢查固氮酶活性。將有活性的菌株通過對應(yīng)無氮培養(yǎng)基劃線分離，待長出單菌落后挑取單菌落接種至對應(yīng)半固體培養(yǎng)基，用乙炔還原法檢測固氮酶活性，再次劃線分離直至獲得純的菌株，最后通過鏡檢觀察其形態(tài)確定是否純化。將純化的菌株分別用15%無菌甘油保存于-80℃（長期保存）和-20℃（日常使用）。

固氮酶活性測定：將獲得的純菌株制成OD600=1的菌懸液，取10 μL菌液接種于3 mL相對應(yīng)的半固體無氮培養(yǎng)基的10 mL試管中，反口膠塞密封。37℃培養(yǎng)12 h后，向管內(nèi)注射1/10體積10%乙炔氣體（使其終濃度為1%），同樣條件再次培養(yǎng)12 h，從管中抽取0.5 mL氣體注入氣相色譜儀（北京天普分析儀器廠SP-2100）中，測定樣品C2H4和C2H2的峰面積。儀器參數(shù)為：柱箱溫度80℃，進(jìn)樣器120℃，F(xiàn)ID 180℃。根據(jù)下列公式計(jì)算固氮酶活性［12］：

EA=（58.0×Se×T×Pe）/（Sb×Te×P×t×V）（μmol·mL-1·h-1）

式中，Se：乙烯峰面積；T：開氏絕對溫度（T=273.13 K）；Pe：實(shí)驗(yàn)條件下大氣壓強(qiáng)（Pa）；Sb：乙炔峰面積；Te：實(shí)驗(yàn)條件下溫度（K）；P：絕對大氣壓強(qiáng)；t：培養(yǎng)時(shí)間；V：容器體積。

1.2.2 細(xì)菌總DNA提取 采用溶菌酶破壁提取DNA，參照畢江濤等［13］方法。

1.2.3 IS-PCR指紋圖譜聚類分析 參照王華榮等［14］方法，以單引物J3（5'-GCTCAGGTCAGGTGGCCTGG-3'）為引物，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，56℃復(fù)性50 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物先用1.5%瓊脂糖電泳初步分析，再用高分辨率PAGE電泳進(jìn)一步聚類分析。電泳圖譜通過凝膠圖像分析軟件GIS3.74分析，獲得電泳圖譜相似性矩陣之后用軟件TREECON進(jìn)行UPGMA聚類。

1.2.4 SDS-PAGE全細(xì)胞蛋白電泳分析 菌株全細(xì)胞可溶性蛋白提取參照譚志遠(yuǎn)等［11］方法。

SDS-PAGE電泳分析：選擇10%分離膠、 5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件先以60 V恒壓30 min左右，待樣品進(jìn)入分離膠之后再以110 V恒壓直到溴酚藍(lán)恰好到達(dá)膠的底部。為便于比較，在IS-PCR聚類基礎(chǔ)上，將同一個(gè)類群菌株集中在同一塊膠上進(jìn)行SDS-PAGE蛋白圖譜分析。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析 參照王華榮等［14］方法，采用通用引物25f：5'-AACTKAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3'和1492r：5'-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3'（K：G或T，Y：C或T）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件同IS-PCR。將PCR產(chǎn)物交由睿博興科生物技術(shù)有限公司，測序引物為PCR擴(kuò)增引物。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對（Blast），獲得相似性較高的公開發(fā)表的模式菌株，再用軟件GeneDoc進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換和人工比對，比對結(jié)果用軟件TREECON采用鄰比法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 nifH基因擴(kuò)增 參照Zehr等［15］方法，采用正向引物Zehrf1：5'-TGYGAYCCNAARGCNGA-3'，反向引物Zehrr2：5'-NDGCCATCATYTCNCC-3'（D：A，G或T；N：A，G，C或T；Y：C或T；R：A或G）。PCR反應(yīng)條件：97℃預(yù)變性3 min；97℃變性1 min，55℃復(fù)性50 s，72℃延伸35 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.7 菌株生理生化鑒定 過氧化氫酶、吲哚產(chǎn)生、甲基紅測定、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)、明膠液化、產(chǎn)氨測定、鐵載體檢測、NO3-還原實(shí)驗(yàn)參照趙斌與何紹江合著的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》［16］進(jìn)行。

溶磷能力定性實(shí)驗(yàn)采用點(diǎn)接PKO培養(yǎng)基［9］，計(jì)算溶磷圈直徑與菌株直徑比值；定量實(shí)驗(yàn)采用鉬銻抗比色法［17］；生長素定量實(shí)驗(yàn)采用Salkowski比色法［18］；ACC脫氨酶活性測定［19］采用2，4-二硝基苯肼比色法，ACC脫氨酶活性（nmol/mg·h）=生成α-丁酮酸含量（nmol）/細(xì)菌蛋白含量（mg）×培養(yǎng)時(shí)間（h）。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生固氮菌的分離、固氮酶活性和部分菌株nifH基因擴(kuò)增

從供試材料中共分離到內(nèi)生固氮菌34株，其中根中分離到28株，莖中分離到4株，葉中分離到2株。各菌株的分離來源和固氮酶活性，見表1。這些菌株的固氮酶活性相差很大，從最低的5.0 nmol/（mL·h）（HU16）到最高的1 036.7 nmol/（mL·h）（HU31），說明其固氮能力存在差異。部分菌株的nifH基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2 IS-PCR指紋圖譜和UPGMA聚類分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用高分辨率6% PAGE電泳獲得的IS-PCR多態(tài)性指紋圖譜聚類結(jié)果見圖2。利用凝膠圖像處理軟件GIS3.74進(jìn)行條帶匹配得到同源性分析表，再利用TREECON以UPGMA方法聚類，34株供試菌株在81%的水平上分為5個(gè)主要類群，結(jié)果見圖3。

2.3 SDS-PAGE全細(xì)胞蛋白電泳圖譜

在IS-PCR聚類基礎(chǔ)上，對34株供試菌株進(jìn)行SDS-PAGE全細(xì)胞蛋白電泳，電泳圖譜見圖4，將得到的電泳圖譜采用同樣的方法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖5。

2.4 16S rRNA基因序列分析

根據(jù)IS-PCR DNA指紋圖譜和SDS-PAGE全細(xì)胞蛋白電泳聚類結(jié)果，挑取每一個(gè)類群中固氮酶活性最高菌株為代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測定，將測定的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的模式菌株序列比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。

表1 內(nèi)生固氮菌的分離部位及各菌株固氮酶活性

圖1 部分代表菌株nifH基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

類群I代表菌株HU33與無乳固氮螺菌（Azospirillum amazonense ATCC 35119T）相似性為97.13%；類群II代表菌株HU31與變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola DSM 15968T）相似性為99.71%；類群III代表菌株HU17與蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii ATCC 700476T） 相 似 性 為99.86%；類群IV代表菌株HU13與黃黃色桿菌（Xanthobacter flavus ATCC 35867T）相似性為100%；類群V代表菌株CM05與越南伯克霍爾德菌（Burkholderia vietnamiensis LMG 10929T）相似性為99.86%。

2.5 代表菌株生理生化鑒定

5個(gè)代表菌株生理生化測定結(jié)果（表2）顯示，所有供試菌株都有過氧化氫酶活性，表明這些內(nèi)生固氮菌能將有毒代謝產(chǎn)物過氧化氫分解保護(hù)自身；除了菌株HU13，其他都有硝酸鹽還原和產(chǎn)氨能力，說明這些菌株在N循環(huán)中可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮化合物；供試菌株將葡萄糖分解為丙酮酸后，不能再被分解為有機(jī)酸，所以甲基紅反應(yīng)為陰性；除了菌株HU13，其他菌株顯V.P陽性反應(yīng)，表明這些菌株能使葡萄糖分解為丙酮酸后再通過縮合和脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴＜谆状?；供試菌株都不能使明膠液化；供試菌株都能分解蛋白胨中色氨酸產(chǎn)生吲哚；HU17、HU31、CMO5能產(chǎn)生鐵載體。

供試菌株在生長過程中都能分泌IAA（3-吲哚-乙酸），菌株分泌IAA濃度在0.5-69.5 μg/mL之間，HU31在有色氨酸存在的情況下產(chǎn)IAA遠(yuǎn)大于其他菌株，這些生物活性物質(zhì)可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)植物生長，細(xì)菌合成IAA根據(jù)前體中是否包括色氨酸可以分為色氨酸途徑和非色氨酸途徑。菌株HU13、HU17、HU31合成IAA濃度比不加色氨酸高，說明這3株菌合成IAA主要是色氨酸途徑，菌株CM05、HU33主要是非色氨酸途徑；菌株CM05和HU31能形成非常明顯的溶磷圈（圖7），說明這些菌株可以分泌出有機(jī)酸使無效態(tài)的磷酸鈣溶解轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟梢晕绽玫挠行B(tài)磷；供試菌株都有ACC脫氨酶活性，菌株活性為23.4-205.3 nmol/（mg·h）。

圖2 IS-PCR指紋圖譜

圖3 IS-PCR指紋圖譜聚類樹狀圖

圖4 內(nèi)生固氮菌全細(xì)胞蛋白電泳圖譜

圖5 全細(xì)胞蛋白電泳圖譜聚類樹狀圖

圖6 代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

3 討論

表2 各類代表菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

插入序列（insertion sequence，IS）是最簡單的轉(zhuǎn)座元件，它的兩側(cè)是短反向末端重復(fù)序列，不同微生物的插入序列數(shù)量和位置存在差異［20］，采用插入序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和數(shù)量也存在差異。微生物屬種確定的標(biāo)準(zhǔn)是菌株與模式菌株的DNA同源性≥70%［21］，蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，關(guān)系密切的細(xì)菌在相同生長期蛋白質(zhì)組成上會有一定的相似性［10，22］。陽潔等［23］采用IS-PCR指紋圖譜和全細(xì)胞蛋白電泳圖譜聚類方式相結(jié)合，將從陳皮中分離得到的23株有益菌分為4個(gè)類群。本研究中采用的IS-PCR指紋圖譜和全細(xì)胞蛋白電泳圖譜分別在DNA水平和全細(xì)胞蛋白質(zhì)水平將所獲菌株在81%相似性以上聚為5個(gè)類群，聚類結(jié)果有較好的一致性，聚類結(jié)果可以相互驗(yàn)證。

內(nèi)生菌生活在植物體內(nèi)，不僅能為宿主植物提供氮素營養(yǎng)，還能分泌生長素、鐵載體和ACC脫氨酶促進(jìn)作物生長、提高作物抗性，并對某些病原菌有拮抗作用，有著生物防治功能，是一類應(yīng)用潛力巨大的微生物資源［24］。本研究采用3種不同的培養(yǎng)基盡可能多的分離不同種屬內(nèi)生固氮菌，共獲得34株內(nèi)生固氮菌，其中菌株大部分來自于根，少數(shù)來自于莖和葉，這與其它植物分離內(nèi)生固氮菌結(jié)果基本一致［9，10］。通過16S rRNA基因序列分析，所獲菌株主要?dú)w屬為固氮螺菌屬、克雷伯氏屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬和伯克霍爾德屬。原紅娟［10］從澳洲野生稻分離獲得內(nèi)生固氮菌有伯克霍爾德屬、克雷伯氏屬、預(yù)研菌屬、草螺菌屬、枝動桿菌屬等。孫建國［25］從小麥、水稻等作物中分離獲得內(nèi)生固氮菌有假單胞菌屬、根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、腸桿菌屬、伯克霍爾德屬和克雷伯氏屬等。這表明不同植物內(nèi)生固氮菌具有生物多樣性，以及種群組成存在差異性，這可能與分離方法、分離季節(jié)以及許多環(huán)境因子等多因素相關(guān)。

近年來國內(nèi)外關(guān)于內(nèi)生菌對農(nóng)作物的應(yīng)用研究很多，許明雙等［26］從水稻種子中分離得到一株檸檬色短小桿菌對水稻種子的萌發(fā)和幼苗促生有明顯效果。尹坤等［27］從岑溪野生稻分離到一株變棲克雷伯氏菌有效促進(jìn)水稻的萌發(fā)和生長。Sang等［28］從韓國水稻分離的內(nèi)生固氮菌有較好的產(chǎn)生長素、產(chǎn)鐵載體和溶磷能力，也能明顯促進(jìn)水稻生長，提高水稻的高度和干重。王志剛等［29］分離到一株溶磷菌對西瓜幼苗根系具有良好的促生作用。韓坤等［30］從鹽生植物海濱錦葵塊根中分離得到5株具有ACC脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌均能提高小麥幼苗的耐鹽性。魯紅學(xué)等［31］從開花期茄子根莖中分離得到一株內(nèi)生枯草芽孢桿菌，不僅能促進(jìn)茄子種子萌發(fā)、幼苗根系生長，還能對茄子黃萎病有很好的生防效果。本研究獲得的固氮菌株都有ACC脫氨酶活性和產(chǎn)生長素能力，有兩個(gè)類群對無機(jī)磷酸鈣有良好的溶解作用，尤其是菌株HU31產(chǎn)生長素能力最高達(dá)到（69.4±4.6）μg/mL，固氮酶活性最高達(dá)到1 036.7 nmol/（mL·h）、ACC脫氨酶活性最高達(dá)到205.3 nmol/（mg·h）、溶磷能力最強(qiáng)達(dá)到（105.4±6.9）μg/mL、具有產(chǎn)鐵載體的能力等眾多植物促生菌的特性，該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用前景。

圖7 菌株的溶磷圈

4 結(jié)論

本研究從藥用野生稻中獲得的5個(gè)類群34株內(nèi)生固氮菌，結(jié)果表明野生稻內(nèi)生固氮菌具有遺傳多樣性，而且所獲得的菌株都有良好的促生菌特性，為微生物肥料生產(chǎn)提供了菌種資源。一般情況下，16S rRNA基因序列同源性低于97%，則可認(rèn)為屬于不同種，同源性低于95%，則可認(rèn)為屬于不同屬［32］。本研究中，被測菌株類群Ⅰ的16S rRNA基因序列與GenBank中無乳固氮螺菌（Azospirillum amazonense ATCC35119T）相似性為97.13%，因此，類群Ⅰ很可能代表一個(gè)新種或新屬，有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation，Identification and Phylogenetic Analysis of Endophytic Diazotrophs in Tengxian Medical-use Oryza officinalis

HU Wen-zhe TAN Ze-wen WANG Yong XU Xian-wei TAN Zhi-yuan
（College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

This research aims to select the endophytic diazotrophs from wild medical-use Oryza officinalis growing on Teng County of Guangxi for collecting the strain resources contributing to the production of microbial fertilizer. Endophytic diazotrophs were isolated from O. officinalis using three selective mediums of free nitrogen and plate streaking method. Acetylene reduction assay was used to determine the activity of nitrogenase in the endophytic diazotrophs. The SDS-PAGE（dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis）patterns of whole-cell proteins and IS-PCR DNA fingerprinting patterns were employed for the clustering analysis of the isolated endophytic diazotrophs. The 16S rRNA gene sequences of the representative strains of each group were analyzed to construct the phylogenetic tree. The abilities of producing auxin，producing siderophores，dissolving phosphorus and the activity of ACC deaminase were tested by colorimetry of spectrophotometer method. Thirty-four strains of endophytic diazotrophs were isolated from O. officinalis and assigned to 5 groups and their nitrogenase activity was between 5.0 to 1 036.7 nmol/（mL·h）. Group I and II each had 8 strains. Group III，IV，V had 2，5，11 strains respectively. The homology of 16S rRNA gene was 97.13% between Group I and Azospirillum amazonense ATCC 35119T，99.71% between Group II and Klebsiella variicola DSM 15968T，99.86% between Group III and Pseudomonas monteilii ATCC 700476T，100% between Group IV and Xanthobacter flavus ATCC 35867T，and 99.86% between Group V and Burkholderia vietnamiensis LMG 10929T. In conclusion，some strains have the ability of producing auxin，producing siderophores，ACC deaminase activity，and dissolving phosphorus. The results suggest that endophytic diazotrophs in medical-use Oryza officinalis present genetic diversity and potential applications in agricultural practices；and group I probably is new.

medical-use Oryza officinalis；endophytic diazotrophs；phylogenetic analysis；whole-cell protein electrophoresis；insertion sequence-based PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.016

2015-09-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370052），廣東省科技項(xiàng)目（2014A030313459，2014A050503058）

胡文哲，男，碩士研究生，研究方向：遺傳育種與生物技術(shù)；E-mail：huwenzhe1216@163.com

譚志遠(yuǎn)，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物固氮和微生物分類；E-mail：zytan@scau.edu.cn