王碩碩，包春輝，王偉靈，戴 明，吳煥淦，王曉梅，翁志軍，劉慧榮，胡智海＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200082；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

艾灸對克羅恩大鼠結(jié)腸RoRγt、Foxp3調(diào)節(jié)作用研究＊

王碩碩1＊＊，包春輝2＊＊，王偉靈1，戴 明3，吳煥淦2，王曉梅2，翁志軍2，劉慧榮2，胡智海1＊＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200082；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

目的：觀察隔藥灸對克羅恩大鼠結(jié)腸Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RoRγt）和Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白P3（Foxp3）的表達(dá)調(diào)節(jié)作用，探討灸法治療克羅恩病的可能效應(yīng)機(jī)制。方法：SPF級雄性SD大鼠40只，完全隨機(jī)分為4組，每組10只：正常組、模型組、隔藥灸組和西藥組（美沙拉嗪），采用三硝基苯磺酸（TNBS）溶液灌腸制備大鼠克羅恩疾病模型，隔藥灸組取穴：天樞（雙）、氣海穴，西藥組：美沙拉嗪灌胃治療。治療干預(yù)結(jié)束后，采用HE病理染色、免疫組織化學(xué)和Real-time PCR方法觀察大鼠結(jié)腸降部組織病理學(xué)變化、Foxp3 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：模型大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)克羅恩病的典型病理表現(xiàn)：裂隙狀潰瘍、黏膜層炎癥伴肉芽腫，Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RoRγt蛋白在模型大鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層表達(dá)高于正常組大鼠（P＜0.01），隔藥灸和美沙拉嗪對RoRγt蛋白具有下調(diào)作用（P＜0.01），且美沙拉嗪的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于隔藥灸（P＜0.01）；Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及其mRNA在模型大鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層表達(dá)均低于正常組大鼠（P＜0.01），隔藥灸和美沙拉嗪對Foxp3及其mRNA都具有上調(diào)作用（P＜0.01），但兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.01）。結(jié)論：隔藥灸可能通過調(diào)節(jié)克羅恩病模型大鼠結(jié)腸黏膜Th17/Treg細(xì)胞平衡中特異性轉(zhuǎn)錄因子RoRγt、Foxp3的表達(dá)來發(fā)揮改善結(jié)腸組織潰瘍，緩解腸道炎癥的治療作用。

克羅恩病 隔藥灸 RoRγt Foxp3

克羅恩?。–rohn’s Disease，CD）屬慢性非特異性腸道炎癥性疾病，目前病因尚不十分清楚的，臨床癥見腹痛、腹瀉、腸梗阻，伴有發(fā)熱、營養(yǎng)障礙等腸外表現(xiàn)，具有慢性和消耗性的特征，病程多遷延難愈，近年發(fā)病率逐年升高[1]。目前，臨床應(yīng)用較多的藥物包括5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、炎性介質(zhì)抑制劑、靶向生物免疫治療、抗生素等[2]。長久服用藥物存在不良反應(yīng)和手術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)率的難點(diǎn)。中醫(yī)針灸治療 克羅恩樣腸腑病癥具有悠久的歷史，現(xiàn)代臨床研究也證實(shí)針灸治療輕中型CD的療效確切，可顯著改善CD患者的全身癥狀，如減少腹瀉次數(shù)、降低CD活動指數(shù)[3-5]，值得進(jìn)一步臨床推廣應(yīng)用和對其效應(yīng)機(jī)制的深入研究。

Thl7細(xì)胞和Treg細(xì)胞在IBD的關(guān)系中日益受到重視，二者存在相互轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。目前，恢復(fù)體內(nèi)的Thl7/Treg平衡對動物模型和IBD患者的療效不斷得到驗(yàn)證[6]。這些研究都補(bǔ)充了 Thl/Th2免疫介導(dǎo)的不足，揭示Thl/Th2亞群失衡并不能說明它們在疾病中起絕對作用。多種療法進(jìn)一步的研究證實(shí)，ThI7/Treg轉(zhuǎn)化平衡是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素，這可能成為人類導(dǎo)致IBD的原因之一[7]。維甲酸相關(guān)孤核受體γt（Retinoid-related Orphannuclear Receptor γt，RORγt）是Thl7細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與自身免疫性疾病、感染和腫瘤等多種病理過程，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義[8]。Treg依賴特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白P3 （FoxP3）以維持穩(wěn)定表達(dá)，釋放IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子來抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活化，維持自身免疫耐受[9]。CD4+T細(xì)胞的亞群各自發(fā)揮不同的功能，并相互制約并且在一定的條件下可以互相轉(zhuǎn)化[10]。Thl7和Treg細(xì)胞各自在調(diào)控免疫反應(yīng)中發(fā)揮了不同的作用。它們參與了免疫炎癥級聯(lián)反應(yīng)中抗原的識別，細(xì)胞信號通路的激活，炎癥效應(yīng)的放大，下游炎性因子的釋放等諸多環(huán)節(jié)。因此，干預(yù)其中任何一個(gè)必要環(huán)節(jié)都可能起到緩解病情的作用[11]。為此，本研究制作CD大鼠模型，從Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RoRγt和Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及其mRNA的調(diào)節(jié)作用角度，來觀察隔藥灸對CD大鼠的治療效果，為灸法治療CD效應(yīng)機(jī)制的闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型制備

SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量140±10 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度20±2℃，相對濕度60±10%，自由飲食飲水，模型制作成功后完全隨機(jī)分組為4組，每組10只：正常組、模型組、隔藥灸組、美沙拉嗪組。參照國際公認(rèn)Morris法[12]制作CD大鼠模型，即TNBS合乙醇溶液灌腸。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24 h，1%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）腹腔麻醉，將5%（W/V）的TNBS與50%乙醇按2:1體積比混合成灌腸液，按照3 mL·kg-1體重，于距肛門6-8 cm處注入灌腸液，1次/周，共4次。

1.2 分組與治療

隔藥灸組取穴：天樞（雙）、氣海，穴位定位參照普通高等教育“十五”國家級規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[13]。藥餅配方：將附子、肉桂、丹參、黃連等藥材研末后加適量黃酒調(diào)和，用模具制成直徑0.5 cm、厚0.3 cm大小，上置約90 mg小艾炷施灸，每次每穴各灸2壯，每日1次，連續(xù)治療10天。美沙拉嗪組：采用美沙拉嗪溶液灌胃。每日投藥量：根據(jù)《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》，按成人（70 kg體重）與大鼠（200 g體重）1:0.018比例配制美沙拉嗪溶液，每日2次投藥，共灌胃10天。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

三硝基苯磺酸TNBS（美國Sigma公司，批號：Q1894）；兔抗大鼠RoRγt、Foxp3 一抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號：SC-28705）；EnVision二抗試劑盒（上?；蚩萍脊荆枺篏K500710）；逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系（上海基爾頓生物科技有限公司）；美沙拉秦腸溶片（德國Losan Pharma GmbH 公司，批號：C1420018878）。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

經(jīng)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.4.2 結(jié)腸組織RoRγt、Foxp3表達(dá)的測定

采用Envision法檢測，石蠟切片進(jìn)行檸檬酸緩沖液微波加熱抗原修復(fù)；0.01 mol·L-1PBS沖洗5 min×3次；0.3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶；0.01 mol·L-1PBS沖洗5 min×3次；滴加兔抗鼠RoRγt（1:500）、Foxp3（1:1 000）一抗，37℃孵育2 h，0.01 mol·L-1PBS沖洗5min×3次；滴加山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；0.01 mol·L-1PBS沖洗5 min× 3次；滴加DAB顯色液（EnVision試劑盒，上?；蚩萍脊荆?，顯微鏡下控制顯色時(shí)間；采用Motic圖像分析系統(tǒng)分析陽性目標(biāo) 平均積分光密度（Integral Optical Density，IOD）。

1.5 Real-time PCR技術(shù)檢測大鼠結(jié)腸Foxp3 的mRNA表達(dá)

從結(jié)腸組織中提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系合成cDNA，相對基因表達(dá)量由CT法來控制。以GAPDH為內(nèi)參照，F(xiàn)oxp3引物由Primer Express設(shè)計(jì)合成。FoxP3-mRNA的Sense：5’-GAGAAAG TGGCAGGGAAGGAGT-3’和Antisense：5’-TCTGAGGCAGGCTGGATAACG-3’。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化（HE染色）

正常組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，未見水腫或增生，腸壁肌層、漿膜層完整。模型組結(jié)腸黏膜面潰瘍，局部黏膜上皮缺失，裂隙狀潰瘍形成，固有層間質(zhì)、黏膜下層結(jié)締組織水腫，大量嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤等炎癥病理表現(xiàn)，符合克羅恩病結(jié)腸病理學(xué)表現(xiàn)。經(jīng)隔藥灸治療后，結(jié)腸組織可見潰瘍愈合，充血水腫程度減輕，黏膜固有層增厚，杯狀細(xì)胞增生。經(jīng)美沙拉嗪治療后，結(jié)腸組織也呈現(xiàn)出同隔藥灸治療組類似的改善。這說明隔藥灸同美沙拉嗪能夠緩解和改善CD大鼠結(jié)腸組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變及炎癥程度，各組大鼠結(jié)腸病理染色如下圖1所示。

圖1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化

2.2 結(jié)腸組織RoRγt、Foxp3表達(dá)情況

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，正常組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞及粘膜固有層單個(gè)核細(xì)胞胞漿中均可見RoRγt蛋白的表達(dá)；與正常組相比，模型組腸黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)、淋巴細(xì)胞RoRγt蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；經(jīng)過隔藥灸和美沙拉嗪治療后，RoRγt蛋白在上述大鼠腸黏膜部位的表達(dá)減弱（P＜0.01），與隔藥灸組相比，美沙拉嗪組的下調(diào)作用更為明顯（P＜0.01），如圖2所示。

正常組大鼠腸黏膜上皮、黏膜間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞Foxp3蛋白均有表達(dá)；與正常組相比，模型組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)減弱（P＜0.01）；隔藥灸和美沙拉嗪能夠上調(diào)Foxp3在上述部位的表達(dá)（P＜0.01），如圖3所示。

2.3 結(jié)腸組織RoRγt、Foxp3 的mRNA表達(dá)

模型組大鼠結(jié)腸組織Foxp3 mRNA表達(dá)量低于正常組大鼠（P＜0.01），隔藥灸組Foxp3 mRNA表達(dá)較模型組明顯上調(diào)（P＜0.01），美沙拉嗪也能夠上調(diào)CD大鼠結(jié)腸Foxp3 mRNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于隔藥灸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），如圖4所示。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織RoRγt蛋白表達(dá)

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織Foxp3蛋白表達(dá)

3 討論

灸法在現(xiàn)代臨床中治療克羅恩病具有很好的療效[14]，尤其在臨床癥狀的改善、病情活動的維持緩解以及防治并發(fā)癥等方面，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)療法相比具有一定優(yōu)勢，可以作為輔助療法用于輕、中度活動期克羅恩病的治療，且操作簡便無副作用，本課題組長期從事針灸治療克羅恩病的臨床與基礎(chǔ)研究工作，作者在臨床有效的基礎(chǔ)上，采用目前國際公認(rèn)的TNBS灌腸法制備實(shí)驗(yàn)性CD大鼠模型，開展針灸治療CD的作用機(jī)制研究。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織Foxp3 mRNA表達(dá)

以往實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，針灸在調(diào)節(jié)Thl/Th2細(xì)胞平衡紊亂方面存在調(diào)節(jié)作用[15，16]，Thl7細(xì)胞和Treg細(xì)胞在IBD的關(guān)系中日益受到重視，二者存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。目前，恢復(fù)體內(nèi)的Thl7/Treg平衡對動物模型和IBD患者的療效均已得到不斷的驗(yàn)證[6]。初始CD4+T細(xì)胞周圍TGF-β濃度較低且存在IL-16時(shí)，TGF-β能誘導(dǎo)RORγt的產(chǎn)生，促使初始CD4+T分化為Thl7細(xì)胞[17]，同時(shí)抑制FoxP3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。而TGF-β濃度較高時(shí)，可上調(diào)FoxP3的表達(dá)，并抑制RORγt的產(chǎn)生，從而阻止初始CD4+T分化為Thl7細(xì)胞。這說明細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的RORγt/FoxP3平衡決定了初始CD4+T受抗原刺激后向Thl7細(xì)胞或Treg方向分化。

本研究檢測了各組大鼠結(jié)腸組織中與Th17細(xì)胞分化發(fā)育具有關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子RORγt。結(jié)果顯示，采用TNBS灌腸方法刺激大鼠，與正常組大鼠相比，模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞RORγt蛋白表達(dá)升高，結(jié)合結(jié)腸炎癥的病理表現(xiàn)，說明RORγt蛋白表達(dá)增加可能增強(qiáng)了黏膜局部幼稚T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化這一過程而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，當(dāng)用隔藥灸和美沙拉嗪干預(yù)后，使得結(jié)腸黏膜RORγt蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，說明在這個(gè)過程中隔藥灸可能通過下調(diào)RORγt蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗炎的作用。作者對具有抗炎作用的Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子FoxP3及其mRNA檢測后發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠相比，模型組大鼠腸黏膜上皮、黏膜間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞質(zhì)FoxP3表達(dá)降低，結(jié)合模型組大鼠結(jié)腸炎癥病理表現(xiàn)，說明轉(zhuǎn)錄因子FoxP3蛋白的降低可能使得Treg細(xì)胞分化受阻而導(dǎo)致炎癥的增強(qiáng)，經(jīng)過隔藥灸和美沙拉嗪治療后，結(jié)腸黏膜FoxP3的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。同時(shí)，結(jié)腸炎癥減輕，對結(jié)腸FoxP3 mRNA的檢測結(jié)果也顯示出類似的變化趨勢，這說明Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子FoxP3在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥過程中發(fā)揮了抗炎作用。以上結(jié)果說明，Thl7細(xì)胞和Treg細(xì)胞中的RoRγt、Foxp3在隔藥灸治療CD的效應(yīng)機(jī)制中也發(fā)揮了重要作用。

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Study on Regulation Function of Moxibustion on Expressions of RoRγt and Foxp3 in Colon of Rats with Crohn Disease

Wang Shuoshuo1, Bao Chunhui2, Wang Weiling1, Dai Ming3, Wu Huangan2, Wang Xiaomei2, Weng Zhijun2, Liu Huirong2, Hu Zhihai1
(1. Shanghai TCM Integrated West Medicine Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200082, China; 2. Shanghai Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai University of TCM, Shanghai 200030, China; 3. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200032, China)

This study was aimed to observe the regulation function of herbs-partition moxibustion on the expressions of RoRγt and Foxp3 in the colon of rats with crohn disease (CD), and to explore the mechanism of moxibustion in the treatment of CD. A total of 40 male SD rats of specific pathogen free grade were randomized into the normal group, the model group, the herbs-partition moxibustion group and the west medicine group (mesalazine), with 10 rats in each group. Trinitro-benzene-sulfonic acid (TNBS) was used to develop CD models.Tianshu(ST25, both sides) andQihai(RE6) were selected in herbs-partition moxibustion group. In the west medicine group, rats

mesalazine by gavage. At the end of the intervention, histopathological changes and Foxp3 mRNA expression in rats’ descending colon were detected by using HE pathological dyeing, immunohistochemistry and real-time PCR. The results showed that colon tissues of rats in the model group expressed typical pathologic signs of CD: crack ulcer and mucosa inflammatory granuloma. The protein expression of RoRγt in the model rat colonic mucosa and submucosa was higher than that of the normal group (P＜ 0.01). Both herbs-partition moxibustion and mesalazine can decrease the protein expression of RoRγt (P＜0.01). The regulation function of mesalazine was stronger than that of herbs-partition moxibustion (P＜0.01). The protein expression of Foxp3 and mRNA in the model rat colonic mucosa and submucosa was lower than that of the normal group (P＜0.01). Both herbs-partition moxibustion and mesalazine can lift the protein expression of Foxp3 and mRNA (P＜0.01), but there was no statistical difference between two groups (P＞0.01). It was concluded that the possibly mechanisms of herbs-partition moxibustion to improve the colon tissue ulcers and alleviate the intestinal inflammation were through the regulation on the expression of RoRγt and Foxp3 in the CD model rat colonic mucosa Th17/Treg cell.

Crohn disease, herbs-partition moxibustion, RoRγt, Foxp3

10.11842/wst.2016.03.007

R245

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2016-03-04

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973計(jì)劃”項(xiàng)目（2015CB554501）：艾灸效應(yīng)的啟動機(jī)制及其內(nèi)源性調(diào)節(jié)作用的機(jī)理研究，負(fù)責(zé)人：吳煥淦；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目（NCET-13-0907）：針灸治療克羅恩病臨床與基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：劉慧榮；上海市科委自然科學(xué)基金基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（13ZR1439400）：艾灸對克羅恩病腸道免疫穩(wěn)態(tài)失衡及腦腸神經(jīng)信息的調(diào)節(jié)機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：劉慧榮；上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目（S30304-A17）：艾灸對克羅恩病大鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：王曉梅。

＊＊ 王碩碩和包春輝為并列第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：胡智海，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：針灸干預(yù)胰島素抵抗研究。