王 珊，高豐琴，楊小玲

(咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

蛋白質(zhì)是組成生命的主要物質(zhì)之一，各種生命活動(dòng)與蛋白質(zhì)都分不開。迄今為止在生命科學(xué)，化學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究中，蛋白質(zhì)的研究一直都占有舉足輕重的地位，特別是對(duì)小分子與蛋白質(zhì)的探究[1-2]。

關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究最主要的是熒光光譜法，從不同的角度來研究分子結(jié)構(gòu)和鍵與鍵之間的結(jié)合效果，以此反映蛋白質(zhì)的功能。近幾年唑草酮?dú)⒉莘秶鷱V、效果明顯、對(duì)后茬作物沒太大的影響，因此在麥田里得到廣泛應(yīng)用[3-6]。這種方法之所以被應(yīng)用于研究唑草酮與牛血清白蛋白之間的相互作用是由于其有很多優(yōu)點(diǎn)，比如靈敏度高，運(yùn)用起來較方便以及用量比較少等。

對(duì)于藥物中小分子與蛋白質(zhì)相互作用的反應(yīng)過程中響應(yīng)信號(hào)的變化，通過具體的分析，確定該響應(yīng)信號(hào)和系統(tǒng)參數(shù)之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，或通過查找探針和合適的蛋白質(zhì)體系結(jié)構(gòu)，改變現(xiàn)有的反應(yīng)模型的缺點(diǎn)，進(jìn)一步得到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),建立一個(gè)更清晰的圖像反應(yīng)，為識(shí)別、篩選和解毒劑的研制提供強(qiáng)有力的依據(jù)。研究農(nóng)藥與血清白蛋白之間的結(jié)合作用，有利于深入了解農(nóng)藥對(duì)人、畜的中毒機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)科學(xué)有效的使用農(nóng)藥具有重要意義[7-8]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白：分析純，百靈威試劑公司；草甘膦銨鹽：質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，分析純，鎮(zhèn)江江南化工有限公司；唑草·苯磺?。悍治黾?，浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司； 三羥甲基氨基甲烷：分析純，天津化學(xué)試劑廠。

SPECORD 50型紫外可見吸收光譜儀：德國(guó)耶拿公司；RF-5301型熒光分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 配制緩沖溶液

(1) 先稱3.634 2 g三羥甲基氨基甲烷(C4H11NO3)，以少量蒸餾水溶解，配成0.1 mol/L的Tris溶液；

(2) 取1 mol/L鹽酸加水配成0.1 mol/L的鹽酸溶液；

(3) 取250 mL 0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液于燒杯中，再加入210 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合溶液pH至7.40，最后用蒸餾水加至刻度處，于陰涼干燥處保存?zhèn)溆茫?/p>

(4) 在天平上稱量氯化鈉固體1.2 g，然后加入41 mL蒸餾水，攪拌使氯化鈉固體溶解，配制成濃度為0.5 mol/L的氯化鈉溶液；

(5) 量取250 mL 0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液于燒杯中，再加入210 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合溶液pH至7.40，最后用蒸餾水加至刻度處。

1.2.2 配制唑草·苯磺隆溶液

在分析天平上稱量0.143 7 g唑草·苯磺隆固體，加入200 mL蒸餾水，在水浴鍋中加熱溶解配制成2×10-3mol/L的溶液。

1.2.3 配制牛血清白蛋白

在分析天平上，準(zhǔn)確稱取0.065 g牛血清白蛋白晶體，用配好的濃度為2.0×10-6mol/L 的Tris-HCl緩沖溶液配成備用液。

1.2.4 不同濃度溶液的配制

(1) 取8個(gè)容量相同的比色管，先分別依次加入2 mL BSA、2 mL NaCl、2 mL Tris-HCl緩沖溶液；

(2)依次加入唑草·苯磺隆除草劑的濃度分別為0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6mol/L，最后用蒸餾水定容到刻度線處，來回?fù)u晃使其混合均勻，在一定溫度下固定放置一段時(shí)間。

1.3 不同濃度唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白熒光光譜的測(cè)定

(1) 將濃度不同且已經(jīng)配好的溶液依次倒入石英比色皿中，熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度是5∶5，固定波長(zhǎng)在280 nm處，依次測(cè)定300～450 nm間光譜，每次記錄最大熒光強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)波常數(shù)；

(2) 在相等溫度下掃描混合溶液的同步熒光光譜等。

2 結(jié)果與討論

2.1 唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白的相互作用

不同濃度的唑草·苯磺隆溶液中BSA的熒光發(fā)射光譜見圖1。從圖1可以知道，BSA最大的吸收峰在347 nm處，BSA的熒光強(qiáng)度隨著唑草·苯磺隆濃度的增大，而顯示有規(guī)律降低的趨勢(shì)，但BSA的峰形沒有發(fā)生大的變化。表明唑草·苯磺隆與BSA之間發(fā)生了相互作用，使熒光物質(zhì)發(fā)生猝滅。

λ/nm1-BSA；2-BSA+ c(藥物)=4×10-6mol/L；3-BSA+ c(藥物)=8×10-6 mol/L；4-BSA+ c(藥物)=12×10-6 mol/L；5-BSA+ c(藥物)=16×10-6 mol/L；6-BSA+ c(藥物)=20×10-6 mol/L；7-BSA+ c(藥物)=24×10-6 mol/L；8-c(藥物)=28×10-6 mol/L，c(BSA)=2×10-6 mol/L圖1 不同濃度唑草·苯磺隆與BSA的發(fā)射熒光光譜

當(dāng)某些小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合，其熒光強(qiáng)度有所下降，這種現(xiàn)象稱為熒光猝滅作用[7-8]?；鶓B(tài)分子和猝滅劑之間的結(jié)合是動(dòng)態(tài)猝滅，它依照Stern-Volmer方程[9]：

F0/F=1+Kqτ0c=1+Ksvc

(1)

式中，c為猝滅劑濃度；τ0為熒光分子的平均壽命，不含有猝滅劑時(shí)其數(shù)值是10-8s；F0為沒有猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；F為含有猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)，L/mol·s，是大分子的熒光壽命和分子擴(kuò)散的衰減速度與相互碰撞的反應(yīng)。

已知生物大分子熒光壽命約為10-8s，各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L/mol·s[10]；由(1)式能夠得到BSA和唑草·苯磺隆反應(yīng)的Stern-Volmer曲線見圖2，其中c(藥物)=4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6mol/L。

c(藥物)×10-6/(mol·L-1)圖2 唑草·苯磺隆與BSA的Stern-Volmer曲線

由直線斜率可求得Ksv=1.5×104L/ mol，進(jìn)一步求得Kq=1.5×1012L/mol·s，因此可知，動(dòng)態(tài)猝滅的假設(shè)不成立，故酮類小分子對(duì)BSA的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅[11]。

靜態(tài)熒光猝滅作用見圖3，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程[12]，即：

(2)

可得出靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB=1.5×104mol/L。

c-1×106/(L·mol-1)圖3 BSA和唑草·苯磺隆的雙倒數(shù)曲線

2.2 唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白的同步熒光光譜

唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白的同步熒光光譜見圖4。

λ/nm1-BSA；2-BSA+ c(藥物)=4×10-6 mol/L；3-BSA+ c(藥物)=8×10-6mol/L；4-BSA+ c(藥物)=12×10-6 mol/L；5-BSA+ c(藥物)=16×10-6 mol/L；6-BSA+ c(藥物)=20×10-6 mol/L；7-BSA+ c(藥物)=24×10-6mol/L；8-c(藥物)=28×10-6 mol/L，c(BSA)=2×10-6 mol/L圖4 不同濃度唑草·苯磺隆與BSA的同步熒光光譜

由圖4可見，明顯具有蛋白質(zhì)的光譜特征。隨著唑草·苯磺隆濃度增大，熒光光譜強(qiáng)度逐漸降低。這說明唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白可能形成了新的化合物，而因此發(fā)生了猝滅作用。目前酮類小分子與牛血清白蛋白的相互作用已有較多研究[13-15]。

熒光分子與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)見圖5，其中c(藥物)=4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6mol/L。

關(guān)系式為：

lg[(F0-F)/F]=lgK0+nlgc

(3)

其中，F(xiàn)0、F和c的意義與式(3)相同；K0為熒光猝滅反應(yīng)的平衡常數(shù)；n為結(jié)合點(diǎn)位數(shù)。以lg[(F0-F)/F]對(duì)lgc作雙對(duì)數(shù)圖，其線性方程的斜率和截距分別為為結(jié)合點(diǎn)位數(shù)n=1和lgK0=4.98。

lgc×10-6圖5 BSA和唑草·苯磺隆的的雙對(duì)數(shù)曲線

2.3 唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白的紫外光譜

不同濃度的唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白的紫外光譜圖見圖6。由圖6可知，隨著藥物濃度的增加，紫外峰的強(qiáng)度逐漸降低。

λ/nm1-BSA；2-BSA+ c(藥物)=4×10-6 mol/L；3-BSA+ c(藥物)=8×10-6mol/L；4-BSA+ c(藥物)=12×10-6 mol/L；5-BSA+ c(藥物)=16×10-6 mol/L；6-BSA+ c(藥物)=20×10-6 mol/L；7-BSA+ c(藥物)=24×10-6mol/L；8-c(藥物)=28×10-6 mol/L，c(BSA)=2×10-6 mol/L圖6 BSA和唑草·苯磺隆的紫外可見吸收光譜

純BSA和純唑草·苯磺隆的紫外可見光譜圖的對(duì)比見圖7。由圖7可知純BSA沒有猝滅作用，說明猝滅作用是由于唑草·苯磺隆與BSA結(jié)合引起的。

λ/nm1-c(藥物)=2×10-3 mol/L；2-c(BSA)=2×10-6 mol/L圖7 純BSA和純唑草·苯磺隆的紫外可見吸收光譜

3 結(jié) 論

通過模擬動(dòng)物體的生理?xiàng)l件，研究唑草·苯磺隆與牛血清白蛋白之間存在的相互作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，BSA與唑草·苯磺隆之間的猝滅方式是靜態(tài)猝滅，得出其靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)是KLB=1.5×104L/(mol·s)，其結(jié)合點(diǎn)位數(shù)n=1。可以為研究唑草·苯磺隆除草劑的藥理、毒理提供依據(jù)，為進(jìn)一步研制解藥提供基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 顏承農(nóng), 張華新，劉義，等.百草枯與牛血清白蛋白結(jié)合作用的熒光光譜[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，63(18)：1727-1732.

[2] 吳漢東，史雪巖，梁沛.順式氰戊菊酯與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2008，25(4)：694-699.

[3] ULRICH K H.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin[J]，Pharmacol Rev，1981，33：17-53.

[4] 陳克海，王玉蓮，郭明，等.長(zhǎng)春新堿與牛血清白蛋白相互作用[J].光譜學(xué)與光譜分析，2008，28(6)：1375-1378.

[5] 張國(guó)文，陳秀霞，潘軍輝，等.桑色素與牛血清白蛋白結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)分析[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(工科版)，2008，30(3)：229-233.

[6] 陳國(guó)珍.熒光分析法[M].北京：科學(xué)出版社，1990：217-221.

[7] CHENG Z J,ZHANG Y T.Fluorometric investigation on the interaction of oleanolic acid with bovine serum albumin[J].Science Direct，2008，879：81-87

[8] WANG N,YE L,YAN F，et al.Spectr oscopic studies ontheinter action of azelnidipine w ith bovine serum albumin [J].International Journal of Pharmaceutics，2008，351(1)：55-60.

[9] 王雪瑞，韓大鋒，賈燕.有機(jī)磷農(nóng)藥與牛血清白蛋白的相互作用以及分析應(yīng)用[J].煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào),2015(3)：194-199.

[10] 王玲，屈凌波，楊冉，等.槲皮素和蘆丁與牛血清白蛋白相互作用研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(6)：719-722.

[11] 顏承農(nóng)，上官云風(fēng)，潘祖亭，等.吡羅昔康與蛋白質(zhì)作用特征的熱力學(xué)研究[J].分析化學(xué)，2004，32(3)：317-319.

[12] 王春，吳秋華，王志，等.槲皮素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2006，26(9)：1672-1675.

[13] 欒尼娜，吳錦繡，宋玉民，等.蘆丁與血清白蛋白結(jié)合作用的熱力學(xué)研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2008，28(4)：856-859.

[14] 張朝紅，臧樹良，耿兵，等.三苯基錫化合物與牛血清白蛋白作用光譜[J].應(yīng)用化學(xué)， 2005，22(5)：489-493.

[15] 鄧世心，楊冬季.熒光法研究牛血清白蛋白與中性紅的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào). 2005，21(2)：184-188.