侯小梅， 魏晶晶， 陳志瓊

（1.重慶醫(yī)科大學，重慶400016；2.重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶402160；3.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510405）

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補腎益智方對老年癡呆癥大鼠腦內氨基酸類神經遞質含量的影響

侯小梅1，2， 魏晶晶3， 陳志瓊1*

（1.重慶醫(yī)科大學，重慶400016；2.重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶402160；3.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510405）

摘要：目的 研究補腎益智方對老年癡呆癥大鼠腦內氨基酸類神經遞質含有量的影響。方法 采用微透析技術收集透析樣品，HPLC-FLU方法檢測老年癡呆癥大鼠腦內天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）和γ-氨基丁酸（γ-GABA）4種氨基酸類神經遞質的含有量。結果 補腎益智方能明顯降低老年癡呆癥大鼠腦內興奮性氨基酸Asp和Glu的含有量，升高抑制性氨基酸Gly和γ-GABA的含有量。結論 補腎益智方能降低興奮性氨基酸含有量，為其防預及緩解老年癡呆癥狀提供一定的理論依據。

關鍵詞：補腎益智方；老年癡呆癥；氨基酸類神經遞質；微透析系統(tǒng)；HPLC-FLU

近年來，老年癡呆癥發(fā)病率大大增加，已成為嚴重威脅老年人健康的疾病之一。老年癡呆主要包括阿爾茨海默病（Alzheimer，s disease，AD）和血管性癡呆（vascular dementia，VD）。AD又名早老性癡呆，是一種多源性因素引起的原發(fā)性大腦神經退行性病變，多伴有乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）活性降低、氨基酸類神經遞質含有量改變，AD患者血漿中興奮性氨基酸類神經遞質有顯著增加，這主要是由于興奮性氨基酸類神經遞質的神經毒性損害機制，即過量的興奮性氨基酸類神經遞質會導致神經細胞死亡［1-5］。目前，仍缺乏有效的防治藥物和方法，文獻報道補腎益智方對D-半乳糖加上鵝膏蕈氨酸（ibotenicacid，IBO）損毀腦Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）的老年性癡呆模型大鼠的學習記憶能力有一定的保護作用［6-7］。本研究在采用D-半乳糖致亞急性衰老作用［6-7］形成腦老化的基礎上，再以IBO損毀NBM［8］建立AD大鼠模型，研究補腎益智方對該AD模型大鼠腦內氨基酸類神經遞質含有量的影響，探討補腎益智方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠50只，雄性，體質量330～350 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（渝）2014-0025。

1.2 藥品與試劑 補腎益智方，由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參、制首烏提取濃縮，制成1.2 kg/L濃縮液（廣東省中醫(yī)院制劑室，批號20140201）。石杉堿甲片（上海復旦復華藥業(yè)有限公司，批號130704，規(guī)格50 μg）。天門冬氨酸（aspartic acid，Asp）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、甘氨酸（glycine，Gly）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， γ-GABA）、2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-MCE）和鵝膏蕈氨酸（ibotenicacid，IBO）均購于美國Sigma公司，批號分別為53931420、43907190、089K07117、026K07361、112K0119和066K3775；鄰苯二甲醛（OPA）購于廣州威佳科技有限公司，批號04121209。乙腈為色譜純（美國Tedia公司）；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.3 儀器 腦立體定位儀（瑞沃德生命科技有限公司）；微透析系統(tǒng)（瑞典CMA公司）；XP205（瑞士梅特勒公司）；DIONEX P680液相色譜儀（美國戴安公司）；酸度計（瑞士梅特勒公司）；Mill-Q超純水機（美國密理博公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、造模與給藥 SD雄性大鼠50只，隨機分為5組，正常對照組注射生理鹽水，模型對照組腹腔注射D-半乳糖［（48 mg/（kg·d）］6周，第7周10％水合氯醛麻醉（3.5 mL/kg，腹腔注射）大鼠后，頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，于頂骨兩側冠狀縫后鉆出小孔。位坐標為前鹵后0.9 mm，中線外側2.6 mm，深7.5 mm，每側用微量注射器分別注人藥液1 μL（含IBO 5 μg/L），速率0.2 L/min，留針5 min，并另開小孔，將微透析探針套管植入海馬區(qū)（前囟后1.6 mm，中線左側1.2 mm，深度6.5 mm）［9-10］，并利用給藥小孔用小螺絲和牙托粉將管套固定，手術后縫合皮膚，48 h內肌注青霉素抗感染，補腎益智方高、中、低劑量組造模均與模型組相同，在手術完48 h后灌胃給予補腎益智方6、3、1.5 g/（kg·d），連續(xù)灌胃5周，正常對照組和模型對照組則以等量生理鹽水灌胃。

1.4.2 透析液的收集 給藥第1天以0計數，每隔5 d將探針與微型注射泵相連，微透析系統(tǒng)灌流，以2 μL/min速率開始灌流人工腦脊液（145 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，pH=7.4），30 min時收集透析液，OPA柱前衍生化后，HPLC-FLU測定Asp、Gly、Glu和γ-GABA含有量。

1.4.3 衍生試劑的配制及衍生化反應 OPA衍生化試劑的配方為20 mg OPA+50 μL 2-MCE +5 mL甲醇+9 mL硼酸緩沖液（0.4 mol/L，pH=9.6）。柱前衍生化反應為20 μL樣品（對照品）+25 μL OPA衍生試劑，渦旋混勻15 s，靜止反應1 min，進樣20 μL（所有操作均避光）［11-13］。

1.4.4 標準貯備液 精密稱取Asp、Glu、Gly和γ-GABA適量置同一500 mL量瓶中，加人工腦脊液至刻度，超聲使其溶解即得到濃度均為40 mmol/L的標準貯備液。

1.4.5 液相色譜條件 Synergi Hydro-RP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）、C18保護柱（4 mm×2 mm，4 μm）均購于美國菲羅門公司；流動相A為乙酸鈉緩沖液（10 mmol/L，冰醋酸調節(jié)pH為5.3），B為乙腈，梯度洗脫（0～3 min，15％B；3～15 min，15％～55％B；15～18 min，55％～15％B；18～23 min，15％B）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；熒光檢測器，激發(fā)波長（λex）及發(fā)射波長（λem）分別為340 nm和455 nm。

1.4.6 數據分析 用SPSS 13.0軟件分析，組間數據比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），數據用均數±標準差（x±s）表示，p<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性實驗 精密吸取大鼠空白腦脊液、標準貯備液及樣品溶液，按“1.4.3”項下方法處理后在“1.4.5”項色譜條件下進樣。由圖1可知，Asp、Glu、Gly和γ-GABA保留時間分別為3.61、4.68、10.97、13.42 min，峰形對稱良好，樣品中其他雜質峰不干擾測定，專屬性理想。

1.Asp 2.Glu 3.Gly 4.GABA圖1　HPLC色譜圖

2.1.2 標準曲線線制備 精密吸取“1.4.4”項下標準應用液，依次配成濃度為0.5、1、2、5、10、20、40 μmol/L的標準液，按“1.4.3”項進行處理后在“1.4.5”項色譜條件下進樣，以峰面積為縱坐標（Y），Asp、Glu、Gly和γ-GABA濃度為橫坐標（X）擬合回歸方程。結果見表1。

表1　標準曲線

2.1.3 精密度試驗 取同一標準品溶液（10 μmol/L），按“1.4.3”方法處理和“1.4.5”條件測定，連續(xù)進樣6次，得到Asp、Glu、Gly和γ-GABA峰面積RSD分別為1.2％、2.7％、1.9％、2.5％，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一標準品溶液（10 μmol/L），按“1.4.3”方法處理和“1.4.5”條件測定，分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，得到Asp、Glu、Gly和γ-GABA峰面積RSD分別為2.1％，1.9％，1.6％和2.8％，表明溶液24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.5 回收率試驗 取含有量已知（Asp、Glu、Gly、γ-GABA）的樣品溶液3份（各20 μL），分別加入含Asp、Glu、Gly和γ-GABA均為10 μmol/L的標準品溶液5、20、80 μL，配成低、中、高（2、5、8 μmol/L）3個濃度，按“1.4.3”條件處理和“1.4.5”條件測定，每個濃度平行測定6次。結果顯示，樣品的加標回收率在92.6％～103.7％之間，RSD在1.2％～3.9％之間，符合定量測定的要求。

2.2 藥理實驗結果

2.2.1 補腎益智方對興奮性氨基酸神經遞質Asp及Glu含有量的影響 與空白對照組相比，模型對照組Asp及Glu明顯降低（p<0.05）；與模型對照組相比，補腎益智方組Asp及Glu隨著給藥時間的增加呈降低趨勢；隨補腎益智方給藥劑量加大，時間持續(xù)，Asp和Glu水平顯著低于模型對照組（p<0.05）。見表2～3。

表2　補腎益智方對大鼠天冬氨酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

表2　補腎益智方對大鼠天冬氨酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，*p<0.05；與空白對照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］Asp/（μmol·L-1）-　 4.48±0.23　 4.50±0.17　 4.39±0.05　 4.51±0.18　 4.42±0.23　 4.47±0.20　 4.42±0.11模型對照組　-　 4.19±0.15※4.12±0.17※4.09±0.14※4.03±0.21※4.01±0.17※3.92±0.22※3.89±0.20※補腎益智方低劑量組　1.5　 4.11±0.08　 4.05±0.19　 3.96±0.22　 3.89±0.09　 3.78±0.08　 3.71±0.24*3.69±0.25*補腎益智方中劑量組　3　4.17±0.17 3.99±0.16 3.85±0.24 3.72±0.13*3.50±0.20*3.47±0.17*3.39±0.06*補腎益智方高劑量組　6　4.19±0.11 3.97±0.24 3.77±0.25*3.65±0.18*3.41±0.12*3.31±0.20*3.19±0.14*

表3　補腎益智方對大鼠谷氨酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

表3　補腎益智方對大鼠谷氨酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，*p<0.05；與空白對照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］Glu/（μmol·L-1）-　 4.98±0.21　 4.93±0.18　 4.89±0.13　 4.91±0.17　 4.89±0.09　 5.05±0.23　 4.99±0.09模型對照組　-　 4.67±0.10※4.55±0.17※4.56±0.15※4.61±0.14※4.62±0.17※4.69±0.14※4.66±0.13※補腎益智方低劑量組　1.5　 4.69±0.12　 4.55±0.24　 4.49±0.08　 4.46±0.21　 4.37±0.15*4.31±0.20*4.24±0.12*補腎益智方中劑量組　3　4.52±0.22 4.38±0.16 4.32±0.19*4.25±0.24*4.07±0.28*3.98±0.15*3.91±0.16*補腎益智方高劑量組　6　4.59±0.14 4.31±0.21*4.18±0.13*4.09±0.26*3.85±0.23*3.77±0.17*3.72±0.14*

2.2.2 補腎益智方對抑制性氨基酸神經遞質Gly和γ-GABA含有量的影響 與空白對照組相比，模型對照組Gly及γ-GABA均明顯降低（p<0.05）；與模型對照組相比，補腎益智方組Gly及γ-GABA隨著給藥時間的增加呈上升趨勢；隨補腎益智方給藥劑量加大，時間持續(xù)，Gly和γ-GABA水平顯著高于模型對照組（p<0.05）。見表4～5。

表4　補腎益智方對大鼠甘氨酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

表4　補腎益智方對大鼠甘氨酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，*p<0.05；與空白對照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］Gly/（μmol·L-1）-　 5.39±0.09　 5.41±0.14　 5.38±0.27　 5.37±0.20　 5.39±0.14　 5.35±0.33　 5.40±0.27模型對照組　-　 4.35±0.11※4.38±0.17※4.44±0.23※4.51±0.25※4.52±0.10※4.48±0.25※4.47±0.30※補腎益智方低劑量組　1.5　 4.42±0.14　 4.53±0.15　 4.55±0.31　 4.57±0.29　 4.63±0.18　 4.61±0.21　 4.65±0.11補腎益智方中劑量組　3　4.38±0.07　 4.54±0.24　 4.59±0.27　 4.71±0.17　 4.77±0.08*4.85±0.27*4.89±0.21*補腎益智方高劑量組　6　4.44±0.17 4.57±0.22 4.79±0.21*4.91±0.13*5.03±0.25*5.12±0.23*5.24±0.19*

表5　補腎益智方對大鼠γ-氨基丁酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

表5　補腎益智方對大鼠γ-氨基丁酸神經遞質含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，*p<0.05；與空白對照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］γ-GABA/（μmol·L-1）-　 6.36±0.13　 6.27±0.17　 6.41±0.25　 6.39±0.27　 6.45±0.23　 6.37±0.17　 6.39±0.25模型對照組　-　 5.34±0.19※5.41±0.25※5.48±0.17※5.50±0.29※5.51±0.27※5.53±0.23※5.54±0.19※補腎益智方低劑量組　1.5　 5.36±0.24　 5.43±0.11　 5.52±0.33　 5.57±0.30　 5.63±0.21　 5.69±0.25　 5.71±0.35補腎益智方中劑量組　3　5.33±0.28　 5.39±0.20　 5.53±0.20　 5.61±0.28　 5.68±0.22　 5.75±0.19　 5.86±0.31*補腎益智方高劑量組　6　5.38±0.23　 5.51±0.18　 5.58±0.29　 5.67±0.26　 5.85±0.26*5.97±0.30*6.08±0.14*

3 討論

缺乏有效的防治手段是當前AD研究中需要解決的主要問題之一。目前在臨床上已經使用的AD治療藥物主要有膽堿酯酶抑制劑、鈣通道阻滯劑和神經營養(yǎng)劑等，但療效均不理想［3-4］。發(fā)揮中醫(yī)用藥特色，尋找有效治療AD的中藥具有十分重要的意義。國內外多篇文獻提示補腎、調心等方藥對實驗性AD模型鼠學習記憶能力有一定的改善作用［6，14-15］。中醫(yī)認為AD等老年癡呆癥的主要病機為腎虛髓虧、腦脈失養(yǎng)。補腎益智方由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參、制首烏中藥組成，是針對AD腎精不足、氣血虧虛的病機而設計的組方；全方具補腎填精、益氣養(yǎng)血、開竅醒神等功效，臨床試用于AD病人已顯示了一定的療效［16］，且實驗室前期水迷宮實驗表明，補腎益智方能顯著提高大鼠學習記憶能力［6，14，17］。

Asp、Glu、Gly和γ-GABA是神經藥理中常涉及到的4種最重要的氨基酸類神經遞質，其中，Asp、Glu是興奮性氨基酸，Gly和γ-GABA是抑制性氨基酸。近幾年，有關興奮性氨基酸和抑制性氨基酸與AD發(fā)病及學習記憶的密切關系已引起重視，一般認為興奮性氨基酸具有神經毒性，興奮性氨基酸的大量釋放可致神經細胞損傷，其機制與Ca2 +超載有關［3，18］，抑制性神經遞質具有突觸后抑制作用，可通過減少Ca2 +內流而發(fā)揮神經保護作用。本實驗發(fā)現，補腎益智方能顯著降低實驗性AD大鼠腦積液中興奮性氨基酸Asp和Glu的含有量，升高抑制性氨基酸Gly和γ-GA-BA的含有量，這可能與其防治AD的機制之一。實驗還發(fā)現模型組動物腦積液中4種氨基酸含有量都明顯低于空白對照組，這可能是由于造模過程加速了動物的衰老和進一步的神經元損傷及退行性病變，而補腎益智方能阻止這種由造模引起的氨基酸含有量的改變，同時提示補腎益智方有一定的神經保護作用。

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*通信作者：陳志瓊（1969—），女，副教授，從事藥物質量控制及有效性評價研究。E-mail：chenzhiqiongcq@163.com

作者簡介：侯小梅（1985—），女，碩士，從事中藥安全性及有效性評價研究。Tel：18182229518，E-mail：379426452@qq.com

收稿日期：2015-02-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.041

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1151-04