周文娟， 詹常森*， 黃昕明

（1.上海和黃藥業(yè)有限公司，上海200331；2.上海中藥固體制劑創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，上海200331）

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HPLC法同時測定腸安顆粒中的3種成分

周文娟1，2， 詹常森1，2*， 黃昕明1，2

（1.上海和黃藥業(yè)有限公司，上海200331；2.上海中藥固體制劑創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，上海200331）

摘要：目的 建立HPLC法同時測定腸安顆粒（白芍、甘草、五味子等）中芍藥苷、甘草苷、五味子醇甲的含有量。方法 分析采用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×25 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫20℃；檢測波長230 nm。結(jié)果 芍藥苷、甘草苷和五味子醇甲分別在0.162 5～0.542 0 μg（r=0.999 9）、0.034 5～0.115 0 μg（r=0.999 6）、0.013 0～0.043 0 μg（r=0.999 7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為102.03％、101.92％、101.98％，RSD均小于3％。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于腸安顆粒的質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞：腸安顆粒；芍藥苷；甘草苷；五味子醇甲；HPLC

腸安顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用多年，已獲新藥臨床批件（批件號2009L01147），由白芍、甘草、五味子、白術(shù)、山藥、柴胡、延胡索、兒茶8味中藥組成，具有健脾益氣，調(diào)肝止瀉之功效?，F(xiàn)代研究表明，腸安顆?？稍鰪?qiáng)體液免疫，對脾虛有一定的治療作用［1］，還可改善腸易激綜合征大鼠的體重與結(jié)腸炎［2］。其中，白芍為臣藥，可調(diào)肝柔肝止痛［3］，所含芍藥苷有補(bǔ)血［4］、鎮(zhèn)痛解痙［5-6］的作用；五味子為佐藥，可澀腸止瀉［7］；甘草益氣補(bǔ)中［8］，而炙甘草更具有“通經(jīng)脈，利血氣”之功效［9］，作為使藥配白術(shù)補(bǔ)脾之氣。為了更好控制腸安顆粒的質(zhì)量，本實驗采用HPLC法同時測定芍藥苷、甘草苷及五味子醇甲的含有量，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察，可為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，包括G1313A檢測器（美國安捷倫公司）；Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×25 mm，5 μm）；AL204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Thermo Scientific移液槍（10～100、100～1 000 μL）。

1.2 試藥 芍藥苷（批號110736-201136）、甘草苷（批號111610-200604）和五味子醇甲（批號110857-201010）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈為色譜純（美國天地公司）；乙醇為分析純（上海展云化工有限公司）；水為去離子水（Millipore系統(tǒng)制備）。腸安顆粒（批號120426、120507和130501）均產(chǎn)自上海和黃藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×25 mm，5 μm）；流動相A為水溶液，B為乙腈溶液，梯度洗脫（程序見表1）；體積流量1.0 mL/min；柱溫20℃；檢測波長230 nm；進(jìn)樣量10 μL；對照品進(jìn)樣量5 μL。在該色譜條件下，3種成分均達(dá)到基線分離，其它成分無干擾，見圖1。

表1　梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program s

1.芍藥苷 2.甘草苷 3.五味子醇甲1.paeoniflorin 2.liquiritin 3.schizandrin圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取芍藥苷、甘草苷、五味子醇甲對照品適量，加50％乙醇溶液制成每1 mL含芍藥苷1.083 8 mg、甘草苷0.229 8 mg及五味子醇甲0.086 4 mg的貯備液。再分別吸取5 mL，置于50 mL量瓶中，50％乙醇定容至刻度，制成每1 mL含芍藥苷0.108 4 mg、甘草苷0.023 0 mg及五味子醇甲0.008 6mg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品0.15 g，置于25 mL棕色量瓶中，加50％乙醇適量，超聲30 min，取出，放冷，50％乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液3、4、6、8、9和10 mL，置于10 mL量瓶中，50％乙醇定容至刻度，搖勻，即得不同質(zhì)量濃度的溶液，在“2.1”項色譜條件下測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2　回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Regression equations and correlation coefficients

2.5 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得芍藥苷、甘草苷、五味子醇甲峰面積RSD分別為0.53％、0.45％、0.39％，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批（批號130501）樣品0.15 g，共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，測得芍藥苷、甘草苷、五味子醇甲平均含有量RSD分別為2.07％、2.49％、2.24％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定，測得芍藥苷、甘草苷、五味子醇甲平均含有量RSD分別為0.41％、1.68％、0.33％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批（批號130501）含有量已知的腸安顆粒6份，每份70 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加入含芍藥苷0.325 0 mg、甘草苷0.061 8 mg及五味子醇甲0.024 9 mg的混合對照品溶液1 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下計算回收率，結(jié)果見表3～5。

表3　芍藥苷加樣回收率試驗結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for paeoniflorin

表4　甘草苷加樣回收率試驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests for liquiritin

表5　五味子醇甲加樣回收率試驗結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests for schizandrin

2.9 樣品含有量測定 取腸安顆粒3批，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，結(jié)果見表6。

表6　含有量測定結(jié)果（n=3）Tab.6 Results of content determ ination（n=3）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 參照文獻(xiàn)［10］，甘草苷用70％乙醇溶解，而芍藥苷與五味子醇甲均用甲醇溶解。然后，對提取溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇、50％乙醇和70％乙醇之間沒有明顯差異，考慮成本問題，最終確定提取溶劑為50％乙醇。

3.2 檢測波長的確定 芍藥苷的最大吸收波長在230 nm附近，而甘草苷及五味子醇甲的最大吸收波長在250 nm附近，并且在230 nm處也有吸收，但芍藥苷無吸收。參照文獻(xiàn)［11-14］，由于在230 nm波長處排除了其他成分的干擾，故最終確定檢測波長為230 nm。

3.3 流動相的優(yōu)化 根據(jù)芍藥苷與甘草苷極性較大，而五味子醇甲極性相對較小的特性，選擇流動相梯度洗脫來進(jìn)行分離。參照文獻(xiàn)［15］，發(fā)現(xiàn)在“2.1”項色譜條件下，3種成分的峰形均較好，保留時間較合適，而且與其他的相鄰峰能完全分離，故最終確定為流動相條件。

3.4 柱溫的考察 在柱溫為20、30、35℃時進(jìn)行樣品分析，比較其對被測成分分離度、峰形和保留時間的影響。結(jié)果，在20℃下，3種成分的分離度、峰形均較好，而且保留時間較合適，故最終確定柱溫為20℃。

3.5 含有量的測定 本實驗采用所建立的方法，對3個不同批次腸安顆粒中芍藥苷、甘草苷及五味子醇甲的含有量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)各批次差異不明顯，表明該工藝比較穩(wěn)定。

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Simultaneous determ ination of three constituents in Changan Granules by HPLC

ZHOUWen-juan1，2， ZHAN Chang-sen1，2*， HUANG Xin-ming1，2
（1.Shanghai Hutchison pharmaceuticals Co.，Ltd.，Shanghai200331，China；2.Shanghai Engineering Research Center for Innovation of Soild p reP-aration of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200331，China）

ABSTRACT：AIM To establish an HPLCmethod for the simultaneous determination of contents of paeoniflorin，liquiritin and schizandrin in Changan Granules（paeonia lactiflora，Glycyrrhiza uralensis，Schisandra chinensis，etc.）.METHODS The analysiswas performed on Kromasil C18column（4.6 mm×25 mm，5 μm）column with its temperature maintained at 20℃，mobile phase was water-acetonitrile with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min，and detection wavelength was set at 230 nm.RESULTS Paeoniflorin，liquiritin and schizandrin showed good linear relationshipswithin the ranges of0.162 5 -0.542 0 μg（r=0.999 9），0.034 5 -0.115 0 μg （r=0.999 6）and 0.013 0 -0.043 0 μg（r=0.999 7），whose average recoveries were 102.03％，101.92％ and 101.98％，respectively.The RSDswere all less than 3％.CONCLUSION This accurate and stablemethod can help tomanage the quality of Changan Granules.

KEY WORDS：Changan Granules；paeoniflorin；liquiritin；schizandrin；HPLC

*通信作者：詹常森（1968—），男，博士，從事中藥活性成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：zhanchangsen@shpl.com.cn

作者簡介：周文娟（1983—），女，碩士，工程師，從事新藥研發(fā)工作。E-mail：wenjuanz@shpl.com.cn

收稿日期：2015-10-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.017

中圖分類號：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1048-04