王海麗

（寶雞市食品藥品檢驗檢測中心，陜西寶雞721013）

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HPLC法同時測定兒童回春顆粒中4種成分

王海麗

（寶雞市食品藥品檢驗檢測中心，陜西寶雞721013）

摘要：目的 建立HPLC法同時測定兒童回春顆粒（葛根、黃芩、牛蒡子等）中葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿。方法 分析采用Atlantis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫25℃。結果 葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿的線性范圍分別為2.92～58.4 μg/mL（r=0.999 8）、2.12～42.4 μg/mL（r=0.999 9）、2.032～40.64 μg/mL（r=0.999 9）、0.80～16 μg/mL（r=0.999 9），平均加樣回收率在99.1％～100.3％之間。結論 該方法簡便、靈敏、準確，可用于兒童回春顆粒的質量控制。

關鍵詞：兒童回春顆粒；葛根素；黃芩苷；牛蒡苷；鹽酸小檗堿；HPLC

兒童回春顆粒屬于常見兒童藥物，具有清熱解毒、透表豁痰的功效，用于急性驚風、傷寒發(fā)熱、臨夜發(fā)燒、小便帶血、麻疹隱現(xiàn)不出引起的身熱咳嗽，以及赤痢、水瀉、食積、腹痛等癥，已應用于臨床多年，效果較好。該制劑由黃連、水牛角濃縮粉、羚羊角、人中白（煅）、淡豆豉、大青葉、荊芥（去粗梗）、羌活、葛根、地黃、川木通、赤芍、黃芩、前胡、玄參（去蘆）、桔梗、柴胡、西河柳、升麻、牛蒡子（炒）20味中藥組成，而現(xiàn)行標準［1］中，只有相關鑒別項，過于簡單，無法保證藥品質量。在兒童回春顆粒中，葛根具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉的功效，其指標成分為葛根素；黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其指標成分為黃芩苷；牛蒡子具有疏散風熱、宣肺透疹、解毒利咽的功效，其指標成分為牛蒡苷；黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其指標成分為鹽酸小檗堿，因此選擇葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿4種成分進行研究。本實驗在參考文獻［2-13］的基礎上，采用HPLC梯度洗脫法同時測定兒童回春顆粒中這4個成分的含有量，以期控制該藥物的質量，為其質量監(jiān)管提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695HPLC色譜儀，包括Waters 2498檢測器；AE-240電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-200VDE三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 葛根素（批號110752-200912，含有量96.0％）、黃芩苷（批號110715-200514，含有量94.0％）、牛蒡苷（批號110819-21309，含有量95.6％）、鹽酸小檗堿（批號110713-201212，含有量86.7％）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。兒童回春顆粒（貴州漢方藥業(yè)有限公司，批號1404102、1406105、1409168）。陰性對照樣品（自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Atlantis C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B）［14］，梯度洗脫（0～10 min，10％～20％A；10～20 min，20％A；20～35 min，20％～30％A；35～45 min，30％～40％A；45～55 min，40％～10％A）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿對照品7.61、11.28、10.63、4.62 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度。精密移取上述對照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得質量濃度分別為0.146、0.212、0.203 2、0.080 mg/mL的混合對照品貯備液。

精密量取貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，得到混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，得到葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿對照品的HPLC色譜圖。見圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 取兒童回春顆粒，研細，精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，甲醇補充減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。在“2.1”項色譜條件下測定，得到兒童回春顆粒樣品的HPLC色譜圖。見圖1。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 按制劑工藝制備不含葛根、黃芩、牛蒡子、黃連的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，在“2.1”項色譜條件下測定，HPLC色譜圖見圖1，陰性對照無干擾。

1.葛根素 2.黃芩苷 3.牛蒡苷 4.鹽酸小檗堿1.puerarin 2.baicalin 3.arctiin 4.berberine hydrochloride圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液1、2、4、6、8、10、15、20 μL，注入HPLC色譜儀，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積，以峰面積積分值（Y）對質量濃度（μg/mL，X）進行線性回歸，得4種活性成分的標準曲線方程、相關系數(shù)（r）和線性范圍，見表1。由表可知，各成分線性關系良好。

表1　4種成分的線性關系Tab.1 Linear relationships of four constituents

2.3.2 精密度試驗 精取吸取同一混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次（n =6），記錄峰面積。結果，葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD值分別為0.61％、0.45％、0.57％、0.73％，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批號（1409168）兒童回春顆粒的供試品溶液適量，于0、2、6、12、24 h后進樣，測定各成分的峰面積。結果，樣品中葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD值分別為0.59％、0.63％、0.48％、0.95％，表明在室溫條件下，供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批號（1409168）供試品適量，研細，精密稱取6份，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定。結果，葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD值分別為0.71％、0.46％、0.92％、1.1％，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的供試品（批號1409168，葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿的質量濃度分別為0.138、0.235、0.216、0.097 2 mg/g）適量，研細，精密稱取6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品溶液1 mL（即質量濃度分別為0.146、0.212、0.203 2、0.080 mg/mL的混合對照品溶液），按“2.2.2”項下方法制備，依法測定。結果表明，該方法回收率良好，見表2。

2.4 含有量測定 取兒童回春顆粒樣品3批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，記錄色譜峰面積，外標法計算含葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿的含有量，結果見表3。

表2　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

表3　含有量測定結果（n=3）Tab.3 Results of content determ ination（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本實驗對4種成分在200～400 nm波長處進行掃描，發(fā)現(xiàn)葛根素在250 nm，黃芩苷在278、316 nm，牛蒡苷在278、229 nm，鹽酸小檗堿在235、265與345 nm處有最大吸收。參考《中國藥典》2010年版一部中黃芩、葛根、牛蒡子、黃連含有量測定項下的檢測波長（葛根素250 nm、黃芩苷280 nm、牛蒡苷280 nm、鹽酸小檗堿265 nm［15］），最終選擇在280 nm處進行測定，此時均有較好的吸收。

3.2 提取方法的選擇 在供試品溶液的制備過程中，為了保證樣品充分提取，本實驗對50％、100％甲醇，30％、50％、70％乙醇分別進行了考察。結果表明，100％甲醇超聲30 min時，提取效果最佳。

3.3 流動相的選擇 兒童回春顆粒有效成分眾多，為了保證分離效果，本實驗以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液為流動相，進行考察。結果發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入磷酸二氫鉀溶液時，保留時間更穩(wěn)定，分離效果較好，故選用乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液作為流動相，進行梯度洗脫。

3.4 其他成分的考察 兒童回春顆粒中含20味中藥，本實驗除對以上4種成分進行研究外，還曾對羚羊角、水牛角、人中白等其他16味作了考察，發(fā)現(xiàn)其對實驗均無干擾。其中，赤芍中芍藥苷在13 min時也可檢出，但因其含有量較低，故未納入研究范疇，而其他成分有待作進一步探討。

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Simultaneous determ ination of four consitituents in Ertong Huichun Granules

WANG Hai-li
（Baoji MuniciPal Food and Drug Testing Center，Baoji721013，China）

ABSTRACT：AIM To establish an HPLCmethod for simultaneously determining puerarin，baicalin，arctiin and berberine hydrochloride in Ertong Huichun Granules（puerariae Radix，Scutellariae Radix，Arctii Fructus，etc.）. METHODS The analysiswas performed on Atlantis C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with its temperature maintained at25℃，mobile phase comprising of acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution in a gradientelution manner，flow rate of1.0 mL/min，and detectivewavelength of280 nm.RESULTS The linear ranges of puerarin，baicalin，actiin and berberine hydrochloride were 2.92 -58.4 μg/mL（r=0.999 8），2.12 -42.4 μg/mL（r=0.999 9），2.032 -40.64 μg/mL（r=0.999 9）and 0.80 -16 μg/mL（r=0.999 9），respectively，whose average recoveries were 99.1％-100.3％.CONCLUSION This simple，sensible and accuratemethod can be applied in the quality control of Ertong Huichun Granules.

KEY WORDS：Ertong Huichun Granules；puerarin；baicalin；arctiin；berberine hydrochloride；HPLC

作者簡介：王海麗，女，主管中藥師，從事中藥檢驗及質量標準起草研究。Tel：（0917）3851855，E-mail：2778108526@qq.com

收稿日期：2015-09-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.016

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1044-04