高翔，張悅，張愛金，付芃，李佳琳，吳建，劉巍△

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Roscovitine在衣霉素誘導足細胞損傷中的保護作用

高翔1,2，張悅3，張愛金1，付芃1，李佳琳1，吳建1，劉巍1△

摘要：目的應用衣霉素誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS），觀察Roscovtine對ERS導致足細胞損傷的保護作用。方法體外培養(yǎng)永生化小鼠足細胞，取37℃分化成熟細胞隨機分組：（1）正常對照組、DMSO組及衣霉素Tunicamycin（1.0 μmol/L，TM）組，各實驗組分別刺激3、6、12 h。（2）正常對照組、Tunicamycin（1.0 μmol/L，TM）組及Tunicamycin+Rosco?vitine（20、40 μmol/L，TM+ROS）組，各實驗組分別刺激12 h。應用流式細胞術及TUNEL法檢測足細胞凋亡情況；應用Western blot檢測細胞周期素依賴性蛋白激酶5（Cdk5）及ERS標志蛋白GRP78、Caspase-12、CHOP的表達變化。結果（1）與正常對照組和DMSO組相比，Tunicamycin刺激3、6及12 h后，TM組足細胞凋亡率及Cdk5、GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達水平均呈明顯的時間依賴性增高（P < 0.05）；（2）加入Roscovitine干預后，與TM組相比，TM+ROS（20、40 μmol/L）組足細胞凋亡率及GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達水平均顯著降低（P < 0.05），其干預作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。結論Cdk5抑制劑Roscovitine能顯著抑制衣霉素誘導的足細胞凋亡，從而發(fā)揮細胞保護作用。Roscovitine的足細胞保護作用可能有助于糖尿病腎病的治療。

關鍵詞：足細胞；凋亡；衣霉素；細胞周期素依賴性蛋白激酶5；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；Roscovitine

△通訊作者E-mail：lwei929@126.com

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的血管并發(fā)癥，是導致糖尿病患者死亡的重要原因之一。研究顯示，足細胞作為腎小球濾過屏障的重要組成部分，其損傷在DN蛋白尿和腎小球硬化的進展中發(fā)揮了重要作用[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（en?doplasmic reticulum stress，ERS）是細胞對各種有害刺激最為關鍵的應答機制，而過度ERS可直接導致細胞功能異常甚至死亡。已有研究顯示，過度ERS導致的足細胞凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[2]。因此，有效地抑制ERS可能會成為治療DN的新方向。然而，目前尚沒有針對DN的特異性ERS抑制劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病大鼠的細胞周期素依賴性蛋白激酶（Cdk）5在足細胞的表達較正常對照大鼠明顯增高，Cdk5參與了ERS介導的細胞凋亡過程，并與大鼠腎功能受損程度密切相關；而Cdk5抑制劑Roscovitine能明顯改善糖尿病大鼠的腎功能，減輕腎組織病變程度[3]。但是，Roscovitine發(fā)揮細胞保護作用的具體機制尚不清楚。本研究通過衣霉素（Tunicamycin，TM）誘導小鼠足細胞凋亡，探討Roscovitine對足細胞過度ERS的影響，以期為DN的治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料條件性永生化小鼠足細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。Cdk5抗體購自美國Epitomics公司；β-actin、GRP78購自美國SAB公司；Caspase-12購自美國Abcam公司；CHOP購自Cell Signaling Technology公司。TM、Roscovitine和Ⅰ型膠原蛋白購自美國Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。重組小鼠γ-干擾素（γ-interferon，γ-IFN）購自美國PeproTech公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)條件性永生化小鼠足細胞培養(yǎng)方法參照文獻[4]。培養(yǎng)時，培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板底部均預先鋪被0.1 g/L的Ⅰ型膠原蛋白。未分化足細胞用含有10%胎牛血清（FBS）、20 U/mL γ-IFN、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促進細胞增殖傳代（許可條件）。許可條件下培養(yǎng)的足細胞按1∶10傳代后，在37℃用不添加γ-IFN的DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）培養(yǎng)10～15 d（非許可條件），誘導足細胞分化成熟。

1.2.2實驗分組足細胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。（1）觀察TM對足細胞凋亡及蛋白表達的影響，細胞分組：正常對照（Control）組、DMSO組、TM（1.0 μmol/L）組，分別刺激3、6、12 h。（2）觀察Roscovitine對TM誘導足細胞凋亡及蛋白表達的影響，細胞分組如下：正常對照（Control）組；TM（1.0 μmol/L）組；TM+Roscovitine（20、40 μmol/L，TM+ ROS）組，各實驗組分別刺激12 h。

1.2.3流式細胞術檢測足細胞凋亡按1.2.2（1）、（2）分組并培養(yǎng)細胞，各實驗組細胞刺激結束后，加入胰酶-EDTA消化細胞，室溫1 000 r/min離心4 min，棄上清，加生理鹽水洗滌2次。收集1×105個細胞，并加入500 μL Binding buffer，反復吹打均勻制成單細胞懸液；分別加入5 μL FITC標記的An? nexin V和5 μL碘化丙啶(PI)，混勻后避光室溫孵育10 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡率，計算各組細胞Annexin-FITC 和PI染色細胞百分含量。

1.2.4Western blot檢驗相關蛋白表達按1.2.2（1）、（2）分組并培養(yǎng)細胞，收集各組細胞，提取總蛋白并行Western blot檢測蛋白表達水平。各組蛋白樣品分別取100 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100℃變性5 min，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入Cdk5（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）、Caspase-12（1∶500）、CHOP（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或鼠免疫球蛋白（Ig）G（1∶5 000），37℃孵育2 h。TBST洗膜后，滴加ECL試劑，于Odyssey FC圖像采集成像系統(tǒng)中顯影，并對條帶進行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結果。

1.2.5TUNEL檢測細胞凋亡率以末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法，按試劑盒說明進行細胞凋亡檢測，DAPI復染細胞核。凋亡足細胞核呈綠色熒光。每張切片于凋亡細胞分布區(qū)域隨機讀取10個高倍視野，計算出平均每100個細胞中的凋亡細胞數(shù)，以百分數(shù)（%）表示凋亡百分率，每張切片重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1TM對足細胞凋亡的影響TM分別處理3、6及12 h后，與對照組和DMSO組相比，TM組足細胞凋亡率均增高（P < 0.05）。同時，TM對足細胞凋亡的影響呈明顯的時間依賴性（P < 0.05），見表1、圖1。

2.2TM對足細胞中Cdk5、GRP78、Caspase-12、CHOP表達的影響與Control組和DMSO組相比，TM刺激3、6及12 h后，足細胞中Cdk5、GRP78、Caspase-12及CHOP蛋白的表達水平均顯著增高（均P < 0.05），并呈明顯的時間依賴性（P < 0.05），見表2、圖2。

Tab.1 The podocyte apoptotic rates treated by TM in three groups表1　TM處理后各組足細胞的凋亡率（n=3，%，±s）

Tab.1 The podocyte apoptotic rates treated by TM in three groups表1　TM處理后各組足細胞的凋亡率（n=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較；b與DMSO組比較；A與3 h組比較；B與6 h組比較，P < 0.05

組別Control組DMSO組TM組F 3 h 3.26±0.74 3.11±0.29 13.79±0.95ab265.66＊6 h 2.99±0.39 3.16±0.62 22.38±1.61abA481.13＊12 h 4.36±0.94 3.97±0.56 34.87±2.56abAB522.96＊F 6.35 0.17 328.71＊

Fig.1 The podocyte apoptotic rates after TM treatment in four groups圖1　TM刺激后各組足細胞凋亡率

Tab. 2 The integrated optical density of proteins after TM treatment in four groups表2　TM刺激后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值（n=3，±s）

Tab. 2 The integrated optical density of proteins after TM treatment in four groups表2　TM刺激后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較,b與DMSO組比較,c與TM 3 h組比較，d與TM 6 h組比較,P＜0.05

組別Control組DMSO組TM 3 h組TM 6 h組TM 12 h組F Cdk5 0.17±0.05 0.24±0.06 0.51±0.09ab0.67±0.03abc0.83±0.06abcd56.45＊GRP78 0.42±0.13 0.40±0.08 0.86±0.05ab1.09±0.13abc1.33±0.17abcd34.41＊Caspase-12 0.16±0.03 0.24±0.02 0.41±0.09ab0.53±0.05abc0.66±0.08abcd33.55＊CHOP 0.06±0.03 0.06±0.02 0.34±0.08ab0.59±0.07abc0.78±0.06abcd96.14＊

Fig.2 Expressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP after TM treatment in four groups圖2　TM刺激后各組Cdk5、GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達情況

2.3Roscovitine對TM誘導足細胞凋亡的影響TM組足細胞凋亡率高于Control組、TM+ROS(20 μmol/L)組和TM+ROS(40 μmol/L)組，并且TM+ROS（40 μmol/L）組細胞凋亡率低于TM+ROS（20 μmol/L）組，Control組凋亡率最低（均P < 0.05）。TUNEL檢測結果顯示，應用Roscovitine干預后，TM+ROS組足細胞凋亡率均顯著低于TM組（均P < 0.05），見表3、圖3。

Tab. 3 Podocyte apoptotic rates detected by flow cytometry and TUNEL after roscovitine treatment表3　流式細胞術和Tunel檢測Roscovitine處理后足細胞凋亡率　（n=3，%，±s）

Tab. 3 Podocyte apoptotic rates detected by flow cytometry and TUNEL after roscovitine treatment表3　流式細胞術和Tunel檢測Roscovitine處理后足細胞凋亡率?。╪=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較；b與TM組比較；c與TM+ROS(20 μmol/L)組比較，P < 0.05；表4同

組別Control組TM組TM+ROS(20 μmol/L)組TM+ROS(40 μmol/L)組F流式細胞術4.82±0.60 37.96±3.54a21.63±1.31ab14.04±1.77abc177.20＊TUNEL 3.19±0.52 38.46±3.31a20.97±1.31ab14.18±1.02abc238.42＊

Fig. 3 The podocyte apoptosis detected by TUNEL (×400)圖3　TUNEL法檢測足細胞凋亡（×400）

2.4Roscovitine對TM誘導足細胞中GRP78、Cas?pase-12和CHOP表達的影響與TM組相比，TM+ROS(20 μmol/L)組和TM+ROS(40 μmol/L)組足細胞中GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表達水平降低（P < 0.05），并且TM+ROS(40 μmol/L)組較TM+ROS(20 μmol/L)組的作用效果更顯著，但這2組蛋白表達水平仍高于Control組（P < 0.05），見表4、圖4。

Tab. 4 The integrated optical density of proteins after roscovitine treatment表4　Roscovitine處理后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值?。╪=3，±s）

Tab. 4 The integrated optical density of proteins after roscovitine treatment表4　Roscovitine處理后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值　（n=3，±s）

組別Control組TM組TM+ROS(20 μmol/L)組TM+ROS(40 μmol/L)組F GRP78 0.46±0.05 2.23±0.38a1.48±0.08ab0.94±0.12abc40.51＊Caspase-12 0.33±0.04 1.88±0.07a0.81±0.08ab0.48±0.05abc349.56＊CHOP 0.28±0.06 2.33±0.38a1.16±0.16ab0.71±0.03abc53.54＊

Fig. 4 Expressions of GRP78, Caspase-12 and CHOP after roscovitine treatment in four groups圖4　Roscovitine處理后各組GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達情況

3　討論

足細胞是一種終末分化的腎小球上皮細胞，附著于腎小球基底膜外側，是參與構成腎小球濾過屏障的關鍵結構。足細胞數(shù)目及密度的下降是導致DN蛋白尿產(chǎn)生和腎小球硬化的重要原因。凋亡是造成足細胞數(shù)目減少的重要原因之一[5]。

一般情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能主要是折疊、修飾和降解分泌蛋白和跨膜蛋白；生理和病理狀態(tài)下，大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積會導致ERS的發(fā)生。糖尿病狀態(tài)下，高糖、ROS、游離脂肪酸、糖基化終產(chǎn)物等因素會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量未折疊蛋白的產(chǎn)生，從而誘發(fā)ERS。ERS導致腎臟固有細胞，如系膜細胞、足細胞凋亡，是促進DN發(fā)生發(fā)展的重要因素[6-7]。因此，抑制ERS可能成為治療DN的一個重要方法。為了研究DN進展中ERS對足細胞的影響，本研究采用TM刺激足細胞，誘導ERS的發(fā)生，結果顯示，TM處理后足細胞內(nèi)ERS標志蛋白GRP78的表達水平高于Control組，并且隨處理時間的延長，ERS相關凋亡蛋白Caspase-12和CHOP的表達水平及足細胞的凋亡率也有增高，提示TM的刺激可以誘導足細胞ERS及凋亡的發(fā)生。

ERS發(fā)生后主要通過ATF6、IRE1和PERK三種跨膜蛋白傳遞信號，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，從而減輕細胞損傷或誘導細胞凋亡[6]。然而，目前尚不清楚是否有其他蛋白介導了ERS引起的細胞凋亡過程。Cdk5是Cdk家族的特殊成員，是脯氨酸限制性絲/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于哺乳動物的細胞內(nèi)。在氧化應激、高血糖、缺氧等因素下，Cdk5可被過度激活并過度磷酸化某些底物，從而導致細胞凋亡，參與多種疾病的發(fā)生[8]。腎組織中，Cdk5表達于足細胞中，對維持足細胞的正常結構及功能有重要作用[9]。在高糖環(huán)境中，足細胞中Cdk5的表達水平及激酶活性有顯著的增高，而抑制Cdk5的表達可以顯著降低高糖誘導的足細胞凋亡，Cdk5的過度表達及過度激活是導致糖尿病足細胞凋亡的原因[10]。Kang等[11]發(fā)現(xiàn)，Cdk5參與了常染色體顯性色素性視網(wǎng)膜炎中ERS導致的細胞凋亡過程，但其是否參與ERS誘導的足細胞凋亡過程尚不清楚。本研究顯示，TM處理后，足細胞中Cdk5的蛋白表達水平顯著高于Control組，并呈明顯的時間依賴性，提示ERS可能通過提高Cdk5的表達水平而誘導足細胞凋亡。

Roscovitine是一種強效的二代細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，對Cdk5的激酶活性具有高效的抑制作用[12]。高濃度Roscovitine處理Heymann腎炎大鼠模型結果顯示，其對腎小球中足細胞有很好的保護作用[13]。筆者前期研究顯示，應用Roscovi?tine處理糖尿病大鼠，能夠有效地減輕糖尿病大鼠腎功能的損傷及病理改變，具有明顯的腎臟保護作用[3]。本研究顯示TM誘導的足細胞凋亡可以被Roscovitine抑制，足細胞凋亡率在Roscovitine干預組顯著低于單純TM處理組，并且40 μmol/L的干預效果顯著優(yōu)于20 μmol/L組。同時，Western blot結果顯示，Roscovintine的干預可以顯著降低足細胞中ERS相關凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的表達水平，表明Cdk5明顯參與了ERS誘導的足細胞凋亡過程，采用Roscovitine抑制Cdk5活性對降低ERS導致的足細胞凋亡具有良好的效果，具有一定的腎臟保護作用。

綜上所述，在DN發(fā)展過程中，ERS可通過增強Cdk5的表達而誘導足細胞凋亡，抑制Cdk5可能會成為治療DN的新靶點。雖然大量體內(nèi)外研究證實Roscovitine可通過抑制Cdk5發(fā)揮神經(jīng)、腎臟等保護功能，并且可以從不同方面干預DN的進展，然而還缺乏長期、大量的臨床研究證實。本研究結果為DN的防治提供了新的思路和方向。

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（2015-06-08收稿2015-08-24修回）

（本文編輯陸榮展）

作者單位：1河北醫(yī)科大學病理學教研室（郵編050017）；2河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院血管外科；3河北醫(yī)科大學診斷學教研室

The role of roscovitine in tunicamycin induced podocyte injury

GAO Xiang1, 2, ZHANG Yue3, ZHANG Ai′jin1, FU Peng1, LI Jialin1, WU Jian1, LIU Wei1△
1 Department of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 2 Department of Vascular Surgery, the Second Hospital of Hebei Medical University, 3 Department of Diagnostics, Hebei Medical University
△Corresponding Author E-mail: lwei929@126.com

Abstract:Objective To observe the protective effects of roscovitine on the podocyte injury induced by endoplasmic reticulum stress (ERS) caused by tunicamycin. Methods The differentiated podocytes cultured at 37℃were randomly di?vided into: (1) Control group, DMSO group and tunicamycin group (TM, 1.0 μmol/L). The treatment was given for 3, 6 and 12 hours in three groups. (2) For control group, tunicamycin group, tunicamycin+roscovitine group (20, 40 μmol/L, TM+ROS), the treatment was given for 12 hours. The podocyte apoptosis was detected by flow cytometry and TUNEL method. The ex?pressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP were detected by Western blot assay. Results (1) Compared with con?trol group and DMSO group, the podocyte apoptosis was increased significantly in a time dependent manner after tunicamy?cin treatment in TM group; the protein expressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP were also up-regulated signifi?cantly in TM group (P < 0.05). (2) Flow cytometry and TUNEL analysis showed that tunicamycin induced apoptosis in podo?cytes, which was significantly inhibited by roscovitine in a concentration dependent manner in TM+ROS group as compared to that of TM group (P < 0.05). The protein expressions of GRP78, Caspase-12 and CHOP were also significantly decreased in a concentration dependent manner in TM+ROS group compared to those of TM group (P < 0.05). Conclusion Roscovi?tine, the inhibitor of Cdk5, can reduce the podocyte apoptosis induced by tunicamycin. The protective effects of roscovitine on podocytes can be a novel approach of treating diabetic nephropathy.

Key words:podocyte; apoptosis; Tunicamycin; Cdk5; endoplasmic reticulum stress; Roscovitine

中圖分類號：R692.6

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59025

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81400731）；河北省自然科學基金資助項目（H2013206139，H2015206257）；河北省衛(wèi)生和計劃生育委員會重點科技研究計劃項目（20130140）；河北醫(yī)科大學大學生創(chuàng)新性實驗計劃資助項目（201410089018）

作者簡介：高翔（1982），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病血管病變研究