丁澤紅 顏彥 付莉莉 黃猛 鐵韋韋 胡偉

摘要：【目的】克隆木薯NAC轉(zhuǎn)錄因子Rd26基因（MeRd26）并檢測(cè)其在干旱脅迫下的表達(dá)量，為Rd26基因抗旱調(diào)控機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。【方法】利用反RT-PCR克隆木薯葉片中的MeRd26基因，對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建，研究其在栽培種Ku50和野生種W14間的變異情況，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)PEG-6000干旱脅迫下的MeRd26基因表達(dá)量?！窘Y(jié)果】從木薯葉片中克隆獲得的MeRd26基因，長度為1288 bp，包含1041 bp的開放閱讀框，編碼346個(gè)氨基酸，且含NAC保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，MeRd26蛋白與楊樹（Potri.011G123300.1）和杞柳（SapurV1A.0127s0020.1）的Rd26蛋白親緣關(guān)系較近。基因結(jié)構(gòu)變異分析結(jié)果顯示，MeRd26基因有33個(gè)SNP位點(diǎn)和7個(gè)InDel位點(diǎn)，且大部分變異分布在非編碼區(qū)及最后一個(gè)外顯子的后半?yún)^(qū)域。基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，在正常大田種植條件下，栽培種Ku50葉片的MeRd26基因表達(dá)量是野生種W14的130倍，但在根中表達(dá)量差異較小；在干旱脅迫下，栽培種Ku50未展開葉、老葉和根中MeRd26基因表達(dá)被快速誘導(dǎo)，表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長而增加，在根中表達(dá)量最高，但在第1片完全展開葉中，MeRd26基因的表達(dá)被抑制，其表達(dá)量明顯降低?！窘Y(jié)論】MeRd26基因在轉(zhuǎn)錄水平上參與了木薯抗干旱脅迫反應(yīng)，可作為候選基因用于木薯抗旱機(jī)制研究。

關(guān)鍵詞： 木薯；NAC轉(zhuǎn)錄因子；Rd26基因；克隆；表達(dá)

中圖分類號(hào)： S533 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）11-1822-05

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to clone NAC transcription factor Rd26 gene（MeRd26） from Manihot esculenta Crantz and detect its expression level under drought stress，in order to provide a foundation for further research on regulation mechanism of MeRd26 gene in response to drought. 【Method】MeRd26 gene was cloned from M. esculenta leaf by RT-PCR，and its sequence was aligned with sequences of other species，then their phylogenetic tree was constructed. Subsequently，its structural variation between wild variety W14 and cultivated variety Ku50 was revealed，and its expression level under PEG-6000 drought stress was detected by quantitive real-time PCR（qPCR）. 【Result】MeRd26 gene was cloned successfully from M. esculenta leaf，with length of 1288 bp，containing open reading frame（1041 bp），encoding 346 amino acids，containing NAC conserved domain. Phylogenetic tree showed that，MeRd26 protein had close genetic relationship with Rd26 protein of Populus trichocarpa（Potri.011G123300.1） and Salix purpurea（SapurV1A.0127s0020.1）. Gene structure variation analysis revealed that MeRd26 gene had 33 SNPs and 7 InDels，and most of these variations were located in the non-coding region and second half of last exon. Expression analysis showed that，MeRd26 gene in leaf of cultivated variety Ku50 was expressed 130 times as that in wild variety W14，while difference was small in root. Under drought stress，expression of MeRd26 gene was rapidly increased in folded leaf，bottom leaf and root with increase of drought stress time，especially in root with the highest expression level. On the contrary，expression of MeRd26 gene was inhibited and reduced obviously in the first fully expanded leaf. 【Conclusion】MeRd26 gene is involved in drought-resistant reaction at transcriptional level，so it can be served as a candidate gene to further study its role in drought-resistant mechanism of M. esculenta.

Key words： Manihot esculenta Crantz； NAC transcription factor； Rd26 gene； clone； expression

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，雖然具有抗旱的生物學(xué)特性，但干旱脅迫仍會(huì)影響木薯的生長和發(fā)育，導(dǎo)致木薯塊根產(chǎn)量減少（Okogbenin et al.，2013）。NAC是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在植物干旱等逆境脅迫中發(fā)揮重要作用（李偉等，2011；孫利軍等，2012）。因此，克隆木薯NAC相關(guān)基因，對(duì)研究其在木薯抗旱中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】自1996年Souer等首次從矮牽牛中克隆獲得NAC基因以來，陸續(xù)在水稻、擬南芥、馬鈴薯、小麥、油菜等物種中發(fā)現(xiàn)NAC成員。經(jīng)研究證實(shí)，大多數(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)保守的N端DNA結(jié)合域、一個(gè)C端可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核定位信號(hào)（Hu et al.，2006）。NAC是一個(gè)龐大的基因家族，如水稻和擬南芥分別含有140和105個(gè)NAC成員。Rd26是一個(gè)重要的NAC轉(zhuǎn)錄因子（Fujita et al.，2004）。Tran等（2007）研究報(bào)道，擬南芥過量表達(dá)Rd26基因（ANAC072），能顯著提高其抗旱能力，其原因是過量表達(dá)Rd26基因的擬南芥會(huì)對(duì)脫落酸極度敏感，脫落酸應(yīng)答基因均上調(diào)表達(dá)，而Rd26基因功能喪失的植株對(duì)脫落酸不敏感，脫落酸應(yīng)答基因的表達(dá)受到抑制，表明Rd26基因通過調(diào)控依賴脫落酸抗逆信號(hào)途徑參與抗旱脅迫反應(yīng)（Fujita et al.，2004）。此外，Rd26基因還與鋅指蛋白ZFHD1直接互作，激活下游基因表達(dá)參與抗旱脅迫反應(yīng)（Tran et al.，2007），且其表達(dá)受鹽、衰老、活性氧、病原體防御等誘導(dǎo)影響（Nuruzzaman et al.，2013）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前已有擬南芥（Tran et al.，2007）、馬鈴薯（Singh et al.，2013）、麻瘋樹（Zhang et al.，2015）等作物Rd26基因參與干旱脅迫的研究報(bào)道，但關(guān)于木薯Rd26基因的研究極少，僅利用cDNA微陣列技術(shù)從3個(gè)木薯品種中分離出168個(gè)干旱脅迫誘導(dǎo)基因，其中包含Rd26基因（Utsumi et al.，2012），但并未對(duì)其進(jìn)行深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆木薯NAC轉(zhuǎn)錄因子Rd26基因（命名為MeRd26），并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)變異、啟動(dòng)子順式作用元件，基因表達(dá)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹展開研究，為揭示MeRd26基因抗旱調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試木薯栽培種Ku50和野生種W14由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；SYBR GreenⅠ試劑盒購自TaKaRa公司。主要儀器設(shè)備：Mx 3005P熒光定量PCR儀、Biometra PCR擴(kuò)增儀、DYY-2C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀及Biorad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)。

1. 2 干旱脅迫處理

在木薯種植季節(jié)，將栽培種Ku50種莖切成長度約15 cm的莖段，挑選帶有芽眼（3～4個(gè)/莖段）且粗細(xì)均勻的莖段扦插于塑料盆（高18.8 cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm）中，1莖段/盆。栽培基質(zhì)是由營養(yǎng)土與蛭石按1∶1體積比配制而成。木薯種植10 d后進(jìn)行間苗，保留1苗/盆。種植60 d后，選取長勢(shì)一致的植株用20% PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，以未經(jīng)PEG-6000干旱脅迫為對(duì)照。干旱脅迫處理0、3和24 h后，分別提取葉片（包括未展開葉、第1片完全展開葉和老葉）和根的RNA進(jìn)行qRT-PCR分析。此外，收集正常大田種植的木薯野生種W14和栽培種Ku50的葉片（種植90 d后）和儲(chǔ)藏根（種植150 d后），用于qRT-PCR分析。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

木薯葉片和根總RNA的提取按照RNA提取試劑盒說明進(jìn)行操作。利用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 引物合成及qPCR

根據(jù)木薯基因組數(shù)據(jù)庫提供的序列（Manes.15G084800.1），利用Primer 6.0設(shè)計(jì)引物，包括MeRd26基因全長引物（L1：5'-TCTACCTCCATTTTCTCTCGT

CC-3'和R1：5'-ACATATGCTCCCCGGAAAAGAA-3'）、actin基因（內(nèi)參基因）引物（L2：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'和R2：5'-CCTCCTACGACCCAATCT

CA-3'）（Xu et al.，2013）和MeRd26基因qPCR特異性引物（L3：5'-GCCCGAGATTGATGACCGAT-3'和R3：5'-

TGGAACCGAGTTAAACCCGG-3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照SYBR GreenⅠ試劑盒說明進(jìn)行pRT-PCR。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。每樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，表達(dá)量按照2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算（胡偉等，2015）。PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 5 生物信息學(xué)分析

用BLAST搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫，獲取與其他物種同源性較高的序列；用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)分析；用MEGA 5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；用DnaSP v5.0進(jìn)行SNP分析及ka/ks計(jì)算；用PlantCARE進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 目的基因的克隆

從采集的葉片中擴(kuò)增出一個(gè)長度為1288 bp的片段（圖1），將其測(cè)序結(jié)果提交至擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，序列相似度達(dá)69.9%，表明已成功獲得MeRd26基因。序列分析結(jié)果顯示，該片段包含81 bp的5'UTR、1041 bp的開放閱讀框和166 bp的3'UTR；共編碼346個(gè)氨基酸，與Phytozome木薯（栽培品種AM506）基因組注釋信息一致。經(jīng)基因組信息比對(duì)，發(fā)現(xiàn)MeRd26基因含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果

蛋白序列同源性比對(duì)結(jié)果（圖2）表明，不同物種的Rd26蛋白均含一個(gè)高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該結(jié)構(gòu)域是蛋白的功能域?；赗d26蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖3）表明，MeRd26蛋白與楊樹（Potri.011G123300.1）和杞柳（SapurV1A.0127s0020.1）的Rd26蛋白親緣關(guān)系較近，同源性分別為73.22%和73.09%。

2. 3 基因結(jié)構(gòu)變異分析結(jié)果

將克隆獲得的MeRd26基因與Phytozome數(shù)據(jù)庫中的3個(gè)木薯材料W14、Ku50和AM506進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，MeRd26基因有33個(gè)SNP位點(diǎn)和7個(gè)InDel位點(diǎn)，且大部分變異分布在非編碼區(qū)（5'UTR、內(nèi)含子和3'UTR）及最后一個(gè)外顯子的后半?yún)^(qū)域；其NAC結(jié)構(gòu)域序列較保守，僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)且均屬于同義突變。此外，將木薯栽培種Ku50和野生種W14的MeRd26基因序列分別與栽培種（AM560）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示MeRd26基因結(jié)構(gòu)變異主要來自于野生種與栽培種間的差異，栽培種與栽培種間的差異較小，僅有2個(gè)SNP位點(diǎn)，且栽培種與野生種ka/ks值為0.305～ 0.385，表明MeRd26基因在木薯進(jìn)化中受到純化選擇。

2. 4 啟動(dòng)子元件分析結(jié)果

對(duì)MeRd26基因起始密碼子上游1500 bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析，發(fā)現(xiàn)存在大量激素相關(guān)的元件，如ABRE（脫落酸順式作用元件）、TCA-element（水楊酸順式作用元件）和GARE-motif（赤霉素順式作用元件）等；此外，還發(fā)現(xiàn)大量光相關(guān)的元件，如ACE、Box I和G-box等，表明MeRd26基因可能參與調(diào)控激素和光相關(guān)的代謝。

2. 5 基因表達(dá)分析結(jié)果

為了驗(yàn)證MeRd26基因在木薯野生種和栽培種間的變異是否引起其表達(dá)水平變化，對(duì)正常大田種植的栽培種Ku50和野生種W14的葉片和根MeRd26基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。栽培種Ku50葉片的MeRd26基因表達(dá)量是野生種W14的130倍，但在根中表達(dá)量差異較小，表明木薯進(jìn)化過程中，堿基變異主要影響MeRd26基因在葉片中的表達(dá)。這可能與該基因的啟動(dòng)子序列變異有關(guān)。

對(duì)干旱脅迫下MeRd26基因在不同木薯組織中表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。栽培種Ku50的未展開葉、老葉和根中MeRd26基因表達(dá)被快速誘導(dǎo)，表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長而增加；在根中表達(dá)量最高，與脅迫前相比，脅迫3和24 h后的表達(dá)量顯著提高了15倍和21倍（P<0.05，下同）；但在第1片完全展開葉中，MeRd26基因的表達(dá)被抑制，與脅迫前相比，脅迫3和24 h后其表達(dá)量顯著下降了200%和300%。綜上所述，MeRd26基因在轉(zhuǎn)錄水平上參與了木薯抗干旱脅迫反應(yīng)，但在不同組織具有不同的調(diào)控功能。

3 討論

由于NAC家族成員的龐大及基因功能的冗余性（李鵬等，2010），其轉(zhuǎn)基因植株難以獲得預(yù)期的表型。因此，須將NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能相聯(lián)系進(jìn)行研究（李偉等，2011）。本研究從木薯中克隆獲得的MeRd26基因，編碼346個(gè)氨基酸，含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，與大部分NAC基因家族成員一致（李鵬等，2010）。此外，無論是栽培種還是野生種，在MeRd26基因編碼蛋白的N端均有一個(gè)高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，但C端具有高度的多態(tài)性，C端的變異均遠(yuǎn)高于N端。這與李鵬等（2010）報(bào)道的在不同物種中N端是高度保守，C端是高度變異區(qū)域的結(jié)論一致，其原因可能與C端是轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制活性有關(guān)（孫利軍等，2012）。本研究還發(fā)現(xiàn)MeRd26基因在木薯栽培種Ku50中的表達(dá)量明顯高于野生種W14，據(jù)此推測(cè)木薯野生種和栽培種間C端堿基變異導(dǎo)致MeRd26基因表達(dá)水平不同。

Rd26基因表達(dá)可被干旱、高鹽、低溫等多種非生物脅迫誘導(dǎo)（Tran et al.，2004；Nuruzzaman et al.，2013），因此，本研究利用PEG-6000溶液對(duì)木薯進(jìn)行干旱脅迫，并檢測(cè)MeRd26基因在不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeRd26基因的表達(dá)在不同葉片（未展開葉、第1片完全展開葉和老葉）和根中均存在顯著差異，與在擬南芥中的研究結(jié)果一致（Fujii et al.，2011）。此外，Rd26基因的表達(dá)可被病原菌侵染等生物脅迫誘導(dǎo)（孫利軍等，2012；Nuruzzaman et al.，2015），但其是否與木薯抗病相關(guān)尚需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得的MeRd26基因在轉(zhuǎn)錄水平上參與了木薯抗干旱脅迫，可作為候選基因用于木薯抗旱機(jī)制研究。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）