晁金泉　陳月異　楊署光　田維敏

摘 要 木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的成分之一，其含量高低影響到細(xì)胞壁的彈性。橡膠樹乳管膨壓是割膠后膠乳排出的初動(dòng)力，乳管細(xì)胞壁的物理性能可能是影響乳管膨壓的因素之一。本研究采用QRT-PCR和RACE技術(shù)， 從巴西橡膠樹無(wú)性系CATAS7-33-97的乳管細(xì)胞中克隆到一個(gè)木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶CCoAOMT基因的同源基因，命名為HbCCoAOMT。該基因的開放閱讀框?yàn)?41 bp，編碼1個(gè)由246個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)分子量為27.76 ku，理論等電點(diǎn)為5.255。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明， 割膠和乙烯利處理均下調(diào)HbCCoAOMT基因在膠乳中的表達(dá)。該基因的表達(dá)量以及內(nèi)層樹皮的木質(zhì)素含量在兩個(gè)橡膠樹品種（CATAS8-79和PR107）間存在顯著差異。HbCCoAOMT差異表達(dá)可能影響到乳管細(xì)胞木質(zhì)素含量和乳管細(xì)胞壁的物理性能。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；HbCCoAOMT；乳管細(xì)胞壁；乳管膨壓；木質(zhì)素

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

木質(zhì)素是一類由香豆醇、松柏醇和芥子醇等單體聚合而成的多酚類物質(zhì)，是植物體內(nèi)一種主要的天然代謝產(chǎn)物，廣泛存在于維管植物次生結(jié)構(gòu)中，對(duì)維持植物組織的硬度和剛性有著重要的意義[1-2]?？Х弱］o酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）屬于植物甲基轉(zhuǎn)移酶類，是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在木質(zhì)素合成時(shí)以咖啡酰輔酶A為底物，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到木質(zhì)素單體的苯環(huán)碳3位置上，形成阿魏酰輔酶A[3]。CCoAOMT的氨基酸序列具有A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H共8個(gè)保守序列元件，其中A， B和C元件是植物甲基化酶所共有的序列，而D，E，F(xiàn)，G和H元件為CCoAOMT特有[4]。作為木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶，CCoAOMT的活性變化將直接調(diào)控木質(zhì)素單體的合成，改變木質(zhì)素在植物細(xì)胞壁中所占的比例，進(jìn)而影響植物次生結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度[5-7]。

橡膠是一種重要的工業(yè)原材料，在國(guó)計(jì)民生中起著重要作用。目前世界上90%以上的天然橡膠均來(lái)源于巴西橡膠樹。橡膠樹樹皮內(nèi)層中的次生乳管細(xì)胞是天然橡膠合成和貯存的場(chǎng)所[8]。通過(guò)切割乳管使膠乳流出到乳管末端堵塞物形成導(dǎo)致排膠停止這一時(shí)間段被稱為排膠的持續(xù)時(shí)間，與天然橡膠產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)[9]。次生乳管是由乳管細(xì)胞彼此連通形成的一種特化組織，保持約8～12個(gè)大氣壓的膨壓[10]。在割膠后，乳管膨壓作為膠乳排出的初動(dòng)力，是影響排膠時(shí)間的重要內(nèi)在因子[11]。目前人們主要從排膠動(dòng)力和排膠阻力對(duì)排膠機(jī)制進(jìn)行研究[12-15]。在排膠阻力方面，主要是探究橡膠凝集的機(jī)理，如Shi等[14]鑒定出C乳清中的Hevb7是膠乳中重要的抗凝集因子；在排膠動(dòng)力方面，主要是解析乳管膨壓形成的生理和分子機(jī)制，如An等[15]克隆了與膨壓形成相關(guān)的水通道蛋白HbPIP2；3，并發(fā)現(xiàn)其在高產(chǎn)品種CATAS8-79中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PR107，但對(duì)于乳管細(xì)胞壁的物理性能對(duì)乳管膨壓的影響尚未有報(bào)道。在本研究中，筆者從乳管細(xì)胞中克隆了一個(gè)木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵基因的同源基因HbCCoAOMT，分析了割膠和乙烯利刺激對(duì)該基因表達(dá)的影響，以及該基因在排膠時(shí)間有顯著差異的兩個(gè)橡膠樹品種（CATAS8-79和PR107）間的表達(dá)模式與內(nèi)層樹皮木質(zhì)素含量的相關(guān)性，初步揭示該基因的差異表達(dá)可能是影響乳管細(xì)胞壁木質(zhì)素含量和乳管膨壓的因素之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用樹 實(shí)驗(yàn)材料為種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)的割齡為3 a的巴西橡膠樹無(wú)性系CATAS7-33-97、CATAS8-79和PR107，以及CATAS7-33-97的未開割樹。

1.1.2 菌株及試劑 Escherichia coli DH10B菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。植物總RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；QRT-PCR熒光染料試劑SYBR Ⅱ premix購(gòu)自TaKaRa公司；引物合成和測(cè)序由Invitrogen公司（上海）完成；其他生化試劑和常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 材料處理 割膠處理選用樹圍一致的CATAS7-33-97的未開割樹和開割樹單株，采用二分之一樹圍割制（S/2）冰上收集膠乳保存于液氮用于RNA的提取。乙烯利處理選用割齡為3 a的CATAS7-33-97開割樹，選樹圍一致的單株，于割膠前2 d用0.5%乙烯利涂抹于割線及其上部約2 cm的割面，采用二分之一樹圍割制（S/2）冰上收集膠乳保存于液氮用于RNA的提取。木質(zhì)素含量測(cè)定選取樹圍一致的CATAS8-79和PR107開割樹單株，用打孔器取離地面1.2 m處樹皮內(nèi)層樣品，液氮保存。另外選取樹圍一致的CATAS8-79和PR107開割樹單株，采用二分之一樹圍割制（S/2）冰上收集膠乳保存于液氮用于RNA的提取。每種實(shí)驗(yàn)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為等量混合3株樹樣品。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 橡膠樹RNA的提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成使用Fementas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit），按照公司操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3 HbCCoAOMT基因的RACE擴(kuò)增和全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增 從課題組前期膠乳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到一段與CCoAOMT高度同源的Unigene30660片段，開放閱讀框分析顯示該序列含有5′UTR序列[9]。根據(jù)序列設(shè)計(jì)3′-RACE引物（3′-RACE-F： CCC AGG ATT GAG ATT TGC ATG，3′-RACE-R： TAC GTT TTT TTT TTT TT），采用Clontech公司Smarter TMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒進(jìn)行3′端序列的克隆。經(jīng)DNAMAN 5.22軟件對(duì)3′端序列與Unigene30660序列進(jìn)行拼接獲取HbCCoAOMT基因的全長(zhǎng)序列（GenBank：KU301753）。以Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)序列的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。引物序列為：HbCCoAOMT-F（ATG GCT TCC AAC AAT GAA CAG）和HbCCoAOMT-R（TCA CTT GAT CCG ACG GCA GAG A）。50 μL擴(kuò)增體系中含cDNA 1 μL、2×TaKaRa PrimeSTAR Max Premix緩沖液25 μL、上下游引物（25 μmol/L）各2 μL及ddH2O 20 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分離后經(jīng)天根生物技術(shù)有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化目的條帶，克隆到全式金公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并挑取陽(yáng)性菌株送Invitrogen公司（上海）測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用NCBI在線軟件ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)；采用DNAMAN 5.22軟件對(duì)HbCCoAOMT基因翻譯及多序列比對(duì)；利用WoLF PSORT在線軟件（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行推導(dǎo)蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行推導(dǎo)蛋白的分子量與等電點(diǎn)預(yù)測(cè)；從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載其他植物的CCoAOMT蛋白序列，利用軟件MEGA4.0以Neighbor Joining（NJ）模型進(jìn)行1 000次boot-strap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)構(gòu)建CCoAOMT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用Bio-Rad公司的CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行HbCCoAOMT基因的相對(duì)定量表達(dá)分析。以合成好的cDNA第一鏈稀釋10倍后作為熒光定量PCR分析的模板。HbCCoAOMT熒光定量引物為QPCR-HbCCoAOMT-F（GAA CCC ATG AAG GAG C）和QPCR-HbCCoAOMT-R（GGA AGA GCA AGA GCA G）。內(nèi)參選取本課題組前期優(yōu)化的橡膠樹穩(wěn)定內(nèi)參HbUBC2b[16]，引物序列為：QPCR-HbUBC2b-F（CGA CCA AGT TTT CAT TTC GGG TG）和QPCR-HbUBC2b-R（AGT CTC TTC TTT GCT GGG GTT G）。20 μL擴(kuò)增體系中含cDNA 1 μL、2×TaKaRa SYBR Premix Ex Taq TMⅡ 10 μL、上下游引物（25 μmol/L）各1 μL及ddH2O 7 μL。QRT-PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 10 s，60 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。利用CFX manager 3.0軟件自動(dòng)進(jìn)行基線和Cq值分析。以HbUBC2b作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct算法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 橡膠樹樹皮內(nèi)層木質(zhì)素含量測(cè)定 木質(zhì)素含量測(cè)定采用乙酰溴法[17]。將保存于液氮中的CATAS8-79和PR107樹皮內(nèi)層材料研磨成粉狀，70 ℃烘箱干燥至恒重。各取5 mg干粉加入5 mL 30%乙酰溴（冰醋酸配制）和0.69 mol/L的高氯酸，封蓋后置于70 ℃水浴1 h，而后加入10 mL 2 mol/L的NaOH和10 mL冰醋酸終止反應(yīng)，并用冰醋酸定容至50 mL。以冰醋酸為空白對(duì)照，在OD=280 nm處測(cè)其吸光值，根據(jù)木質(zhì)素回歸曲線[17]計(jì)算所測(cè)樣品中木質(zhì)素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbCCoAOMT基因的克隆及生物信息學(xué)分析

通過(guò)3′-RACE方法及測(cè)序從橡膠樹無(wú)性系CATAS7-33-97膠乳中得到1條長(zhǎng)236 bp的片段，經(jīng)DNAMAN將其與Unigene30660拼接后獲得1條包含橡膠樹HbCCoAOMT基因完整開放閱讀框的cDNA序列（KU301753）。該序列長(zhǎng)度為973 bp，含有1個(gè)741 bp的開放閱讀框，5′端非翻譯區(qū)為62 bp，3′端非翻譯區(qū)為170 bp（圖1）。ProtParam tool軟件預(yù)測(cè)該基因編碼了1個(gè)由246個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，其分子量大小約為27.76 ku，理論等電點(diǎn)為5.255，屬于弱堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HbCCoAOMT蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 HbCCoAOMT推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建

序列相似性分析結(jié)果表明HbCCoAOMT蛋白序列與蓖麻RcCCoAOMT（XP_002518739.1）、棉花GhCCoAOMT（ACF48821.1）、楊樹PeCCoAOMT（XP_

011000746.1）、油菜BrCCoAOMT（XP_009138259.1）、馬鈴薯StCCoAOMT（XP_006339880.1）蛋白相似性分別為92%、90%、90%、87%和86%（圖2），均含有CCoAOMT蛋白所特有A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H結(jié)構(gòu)元件。

為研究橡膠樹HbCCoAOMT與其他CCoAOMT蛋白在進(jìn)化上的關(guān)系，選取葡萄[18]、煙草[19]、野茶樹[20]、苜蓿[21]、黃麻[22]、玉米[6]、擬南芥[23]、輻射松[5]等8個(gè)物種的CCoAOMT蛋白序列，利用Mega 6.06軟件，采用Neighbor-Joining，進(jìn)行1 000次 bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3）。聚類結(jié)果表明植物CCoAOMT蛋白家族可分為兩個(gè)亞類（Ⅰ和Ⅱ），其中橡膠樹與葡萄、煙草、野茶樹、苜蓿歸為Ⅰ亞類，并且與苜蓿的同源蛋白MsCCoAOMT親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.3 割膠和乙烯利處理對(duì)HbCCoAOMT基因表達(dá)的影響

割膠是獲取天然橡膠的唯一方式[10]。QRT-PCR結(jié)果表明HbCCoAOMT基因在開割樹膠乳中的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為未開割樹膠乳中的八分之一（圖4-A），說(shuō)明割膠可顯著抑制HbCCoAOMT基因表達(dá)。乙烯利是一種乙烯釋放劑，生產(chǎn)上可顯著延長(zhǎng)排膠時(shí)間達(dá)到增產(chǎn)的目的[24]。本研究發(fā)現(xiàn)施用乙烯利可顯著下調(diào)HbCCoAOMT基因的表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的一半（圖4-B）。

2.4 不同橡膠樹品種HbCCoAOMT基因的表達(dá)量與木質(zhì)素含量測(cè)定

分別測(cè)定排膠時(shí)間長(zhǎng)的橡膠樹品種CATAS8-79和排膠時(shí)間短的橡膠樹品種PR107膠乳中HbCCoAOMT基因的表達(dá)量以及其樹皮內(nèi)層的木質(zhì)素含量。結(jié)果表明CATAS8-79的HbCCoAOMT基因表達(dá)量（圖5-A）以及木質(zhì)素含量（圖5-B）均顯著低于PR107。

3 討論

植物細(xì)胞膨壓是細(xì)胞吸水對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生的壓力，對(duì)于保持細(xì)胞的緊張度，維持植物體正常的生命活動(dòng)有著重要的生理學(xué)意義[25]。根據(jù)細(xì)胞壁體積彈性模量學(xué)說(shuō)，細(xì)胞壁的可塑性越大表明細(xì)胞壁越柔軟，維持的膨壓越高；相反細(xì)胞壁越堅(jiān)硬，膨壓也就越低[26]。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的成分之一，其含量高低與細(xì)胞壁的可塑性負(fù)相關(guān)，影響植物生長(zhǎng)。Zhang等[27]對(duì)白樺的木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因BpCCR干涉后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)素含量顯著下降，但生長(zhǎng)速度卻得到了明顯提高，這可能是由于木質(zhì)素含量降低增強(qiáng)了細(xì)胞壁的可塑性，利于細(xì)胞膨大。謝兆森等[28]研究表明在葡萄的第1次快速生長(zhǎng)期內(nèi)果肉細(xì)胞膨壓快速升高，這一過(guò)程伴隨著維管束結(jié)構(gòu)大量消失，認(rèn)為木質(zhì)素減少導(dǎo)致的細(xì)胞壁延伸性增強(qiáng)是葡萄果實(shí)急劇膨大的原因所在。在天然橡膠生產(chǎn)中，割膠后的排膠持續(xù)時(shí)間是影響天然橡膠產(chǎn)量的重要因素之一。不同橡膠樹品種間排膠持續(xù)時(shí)間有明顯差異，并且割膠和施用乙烯利均可顯著延長(zhǎng)排膠時(shí)間，進(jìn)而達(dá)到增產(chǎn)的目的[9-10，24]。作為膠乳排出的初動(dòng)力，人們長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于乳管膨壓的認(rèn)識(shí)僅僅停留在水份進(jìn)出乳管細(xì)胞以及割膠后的傷口阻礙方面[12-13，15，29]，而忽視了次生乳管細(xì)胞壁的物理性能在其中的作用。

本研究從橡膠樹膠乳中克隆了一個(gè)編碼木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶CCoAOMT的基因的同源基因HbCCoAOMT。氨基酸序列分析表明，HbCCoAOMT具有典型的CCoAOMT家族保守結(jié)構(gòu)域，其中A，B，E，F(xiàn)，G，H元件在不同成員間保守性較高，而C和D元件保守性較差，這可能與物種特異性有關(guān)。系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明HbCCoAOMT屬于植物CCoAOMT家族I亞類，與來(lái)自苜蓿的同源蛋白MsCCoAOMT親緣關(guān)系最近。在苜蓿中，抑制MsCCoAOMT基因的表達(dá)可顯著降低木質(zhì)素的含量，并且通過(guò)降低G型木質(zhì)素單體進(jìn)而改變G/S木質(zhì)素比例[21]。割膠和乙烯利刺激均可顯著延長(zhǎng)橡膠樹的排膠持續(xù)時(shí)間[10，24]。在排膠動(dòng)力方面，主要認(rèn)為乙烯利刺激的這種效應(yīng)與調(diào)節(jié)水通道蛋白有關(guān)[15]。在排膠阻力方面，以往認(rèn)為乙烯利刺激的這種效應(yīng)與提高黃色體的穩(wěn)定性有關(guān)[24]。但最近研究證明，這種效應(yīng)與膠乳C-乳清中的一種Hevb7蛋白有關(guān)。該蛋白可抑制橡膠粒子與黃色體膜碎片和B-乳清中的蛋白結(jié)合，從而延緩乳管傷口堵塞[14]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)割膠和乙烯利刺激均可顯著下調(diào)HbCCoAOMT基因的表達(dá)，這可能導(dǎo)致乳管細(xì)胞壁的木質(zhì)素含量降低，進(jìn)而降低乳管細(xì)胞壁剛性，維持較高的乳管膨壓，增大排膠的初動(dòng)力。橡膠樹品種CATAS8-79和PR107在排膠持續(xù)時(shí)間上存在顯著差異，前者的排膠持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于后者[9]。An 等[26]利用實(shí)時(shí)膨壓測(cè)定儀測(cè)定了兩者的樹干樹皮膨壓，證明CATAS8-79的乳管膨壓要明顯高于PR107。本研究表明，HbCCoAOMT在CATAS8-79膠乳中的表達(dá)量顯著低于PR107，并且CATAS8-79樹皮內(nèi)層的木質(zhì)素含量也顯著低于PR107。這些結(jié)果表明HbCCoAOMT差異表達(dá)可能與乳管細(xì)胞木質(zhì)素含量差異有關(guān)，是影響乳管細(xì)胞壁的物理性能和乳管細(xì)胞膨壓的因素之一。

參考文獻(xiàn)

[1] Bonawitz N D， Kim J I， Tobimatsu Y， et al. Disruption of Mediator rescues the stunted growth of a lignin-deficient Arabidopsis mutant[J]. Nature， 2014， 509： 376-380.

[2] Mandal S， Kar I， Mukherjee A K， et al. Elicitor-induced defense responsesin Solanum lycopersicum against Ralstonia solanacearum[J]. Sci World J， 2013， 25： 561056.

[3] Whetten R， Sederoff R. Lignin biosynthesis[J]. Plant Cell， 1995， 7（7）： 1 001-1 013.

[4] Joshi C P， Chiang V L. Conserved sequence motifs in plant S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases[J]. Plant Mol Biol， 1998， 37（4）： 663-674.

[5] Wagner A， Tobimatsu Y， Phillips L， et al. CCoAOMT suppression modifies lignin composition in Pinus radiata[J]. Plant J， 2011， 67： 119-129.

[6] Li X， Chen W， Zhao Y， et al. Downregulation of caffeoyl-CoA O-methyltransferase（CCoAOMT）by RNA interference leads to reduced lignin production in maize straw[J]. Genet Mol Biol， 2013， 36： 540-546.

[7] Li W， Tian Z， Yu D. WRKY13 acts in stem development in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Sci， 2015， 236： 205-213.

[8] Chow K S， Mat-Isa M N， Bahari A， et al. Metabolic routes affecting rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis latex[J]. J Exp Bot， 2012， 63： 1 863-1 871.

[9] Chao J， Chen Y， Wu S， et al. Comparative transcriptome analysis of latex from rubber tree clone CATAS8-79 and PR107 reveals new cues for the regulation of latex regeneration and duration of latex flow[J]. BMC Plant Biol， 2015， 15： 104.

[10] Tang C， Huang D， Yang J， et al. The sucrose transporter HbSUT3 plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. Plant Cell Environ， 2010， 33（10）： 1 708-1 720.

[11] Jacob J L， Prevot J C， Roussel D， et al. Physiology of Rubber Tree Latex[M]. Boca Raton， Fla. ： CRC Press， 1989： 345-382.

[12] Buttery B R， Boatman S G. Turgor Pressures in Phloem： Measurements on Hevea Latex[J]. Science， 1964， 145： 285-286.

[13] 安 鋒， 曾憲海， 林位夫. 橡膠樹乳管膨壓的測(cè)定技術(shù)及其變化規(guī)律[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（1）： 151-157.

[14] Shi M J， Cai F G， Tian W M. Ethrel-stimulated prolongation of latex flow in the rubber tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）： an Hev b 7-like protein acts as a universal antagonist of rubber particle aggregating factors from lutoids and C-serum[J]. J Biochem， 2016， 159（2）： 209-216.

[15] An F， Zou Z， Cai X， et al. Regulation of HbPIP2；3， a Latex-Abundant Water Transporter， Is Associated with Latex Dilution and Yield in the Rubber Tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）[J]. PLoS One， 2015， 10（4）： e0125595.

[16] Chao J， Yang S， Chen Y， et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis of the gene expression in laticifers on the basis of latex flow in rubber tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）[J]. Front Plant Sci， 2016， 7： 1 149.

[17] 王建慶， 曹佃元， 張 玉. 乙酰溴法測(cè)定棉籽殼中木質(zhì)素的含量[J]. 紡織學(xué)報(bào)， 2013， 34（9）： 12-16.

[18] Busam G， Junghanns K T， Kneusel R E， et al. Characterization and expression of caffeoyl-coenzyme A 3-O-methyltransferase proposed for the induced resistance response of Vitis vinifera L[J]. Plant Physiol， 1997， 115： 1 039-1 048.

[19] Martz F， Maury S， Pinc， on G， et al. cDNA cloning， substrate specificity and expression study of tobacco caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase， a lignin biosynthetic enzyme[J]. Plant Mol Biol， 1998， 36（3）： 427-437.

[20] Zhang Y， Lv H P， Ma C Y， et al. Cloning of a caffeoyl-coenzyme A O-methyltransferase from Camellia sinensis and analysis of its catalytic activity[J]. J Zhejiang Univ Sci B， 2015， 16（2）： 103-112.

[21] Guo D， Chen F， Inoue K， et al. Downregulation of caffeic acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase in transgenic alfalfa impacts on lignin structure and implications for the biosynthesis of G and S lignin[J]. Plant Cell， 2001， 13（1）： 73-88.

[22] Zhang G， Zhang Y， Xu J， et al. The CCoAOMT1 gene from jute（Corchorus capsularis L.）is involved in lignin biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Gene， 2014， 546（2）： 398-402.

[23] Do C T， Pollet B， Thévenin J， et al. Both caffeoyl Coenzyme A 3-O-methyltransferase 1 and caffeic acid O-methyltransferase 1 are involved in redundant functions for lignin， flavonoids and sinapoyl malate biosynthesis in Arabidopsis[J]. Planta， 2007， 226（5）： 1 117-1 129.

[24] Zhu J， Zhang Z. Ethylene stimulation of latex production in Hevea brasiliensis[J]. Plant Signal Behav， 2009， 4： 1 072-1 074.

[25] Chen L Y， Shi D Q， Zhang W J， et al. The Arabidopsis alkaline ceramidase TOD1 is a key turgor pressure regulator in plant cells[J]. Nat Commun， 2015， 16（6）： 6030.

[26] Steudle E. Water Deficits： Plant Responses from Cell to Community[M]. Oxford， UK： Bios Scientific Publishers， 1993： 5-36.

[27] Zhang W， Wei R， Chen S， et al. Functional characterization of CCR in birch（Betula platyphylla × Betula pendula）through overexpression and suppression analysis[J]. Physiol Plant， 2015， 154（2）： 283-296.

[28] 謝兆森， 曹紅梅， 李 勃， 等. 巨峰葡萄果實(shí)不同發(fā)育期維管束水分運(yùn)輸變化[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（1）： 111-117.

[29] An F， Cahill D， Rookes J， et al. Real-time measurement of phloem turgor pressure in Hevea brasiliensis with a modified cell pressure probe[J]. Botanical Studies， 2014， 55： 19.