郇志博　謝德芳

摘 要 建立一種利用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定豬肉、雞肉、雞蛋和牛奶中三唑酮和三唑醇殘留的分析方法，其中使用乙腈提取，GC/NH2固相萃取小柱凈化。結(jié)果顯示：建立的分析方法線性、精確度和準確度滿足SANCO/12571/2013要求，靈敏度滿足CAC要求，而且操作步驟簡單，耗時短，對大批量樣品來說大大提升了檢測效率。

關(guān)鍵詞 三唑酮；三唑醇；分析方法；動物源

中圖分類號 O657.63 文獻標識碼 A

三唑酮（Triadimefon）別稱“粉銹寧”，由德國拜耳公司于1973年推出，是一種高效、低毒、內(nèi)吸性強的廣譜三唑類殺菌劑，主要用于防治植物真菌病害如銹病、白粉病等。三唑類殺菌劑主要是通過抑制菌體麥角甾醇的生物合成，抑制細胞色素多功能氧化酶的催化反應(yīng)進而抑制或干擾菌體附著孢及吸器發(fā)育、菌絲生長、孢子形成，從而導(dǎo)致病菌死亡。在動植物體內(nèi)，三唑酮分子中的羰基被還原成羥基，生成三唑醇（triadimenol），三唑醇的殺菌活性要高于三唑酮[1]。由于殺菌性能優(yōu)越，三唑醇被作為一種單獨的藥劑在多種作物上登記使用，別名“羥銹寧”，對小麥、玉米、高粱黑穗病、白粉病、銹病、條紋病等防效十分顯著[2]。經(jīng)查詢，目前中國三唑酮的登記作物包括菜豆、小麥、番茄、觀賞菊花、花生、黃瓜、豇豆、梨樹、棉花、蘋果樹、水稻、甜菜、豌豆、西瓜、橡膠樹、煙草、油菜、玉米、水稻，涉及318家企業(yè)的824種農(nóng)藥產(chǎn)品；三唑醇的登記作物包括：小麥、高粱、花生、水稻、甜菜、香蕉、玉米，涉及21家企業(yè)的55種農(nóng)藥產(chǎn)品[3]。

三唑酮和三唑醇是中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用非常廣泛的2種殺菌劑，但其在作物、土壤和水體中的殘留，也給生物安全和健康帶來了負面影響[4]。研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮與三唑醇會產(chǎn)生神經(jīng)[5]、生殖[6]、內(nèi)分泌[7]和基因毒性[8]，并有致癌和致畸性[8-9]。為保證2種農(nóng)藥的科學(xué)合理使用和消費者的食品安全，中國制定了三唑酮在稻谷、小麥等作物上的26條殘留限量標準，制定了三唑醇在稻谷、小麥等作物上的20條殘留限量標準[10]。從2種藥劑的登記作物來看，玉米、小麥和水稻為主要登記作物，而這些作物是畜禽的主要飼料來源，為保障畜禽產(chǎn)品的食品安全，國際食品法典委員會CAC（Codex Alimentarius Commission）還制定了2種藥劑在豬肉、雞肉、牛奶和雞蛋等畜禽產(chǎn)品中的殘留限量[11]。近年來隨著國家對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重視，農(nóng)業(yè)部要求必須豐富和完善中國的農(nóng)獸藥殘留標準體系，其中轉(zhuǎn)化CAC動物源產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留限量標準是其中的重要一環(huán)。開展CAC限量標準轉(zhuǎn)化工作的基礎(chǔ)是畜禽產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測，經(jīng)查閱，中國目前制定的三唑醇和三唑酮在動物源產(chǎn)品中的殘留檢測標準包括GB/T 19650-2006[12]、GB/T 23210-2008[13]、GB/T 20772-2008[14]和SN/T 2232-2008[15]，但標準GB/T19650-2006、GB/T 23210-2008和SN/T 2232-2008的定量限低于CAC要求，標準GB/T 20772-2008需要使用繁瑣的凝膠滲透色譜凈化，而且4個標準都不能同時檢測豬肉、雞肉、牛奶和雞蛋4種代表性動物源基質(zhì)。

武婷等[16]建立了利用超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定果蔬中三唑酮殘留的方法，王玉健等建立了利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中三唑酮殘留的方法[17]，黃超群等建立了利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中三唑醇殘留的方法[18]，王明月和林靖凌建立了利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定香蕉中三唑醇殘留的方法[19]，王敬等建立了利用氣相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時測定牛奶和奶粉中三唑酮和三唑醇殘留的方法[20]，沈偉健等建立了利用氣相色譜-負化學(xué)離子源質(zhì)譜測定牛肉中三唑醇殘留的分析方法[21]，鄭軍紅等建立了利用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定牛奶中三唑醇殘留的分析方法[22]，但目前尚未檢索到關(guān)于同時測定豬肉、雞肉和雞蛋中三唑酮和三唑醇殘留的分析方法的文獻報道，且王敬等人建立的牛奶和奶粉中三唑酮和三唑醇的殘留測定方法檢測限較高[20]。由于動物基質(zhì)不同于植物基質(zhì)，含有較多的脂肪和蛋白質(zhì)，大大增加了三唑酮和三唑醇這類脂溶性農(nóng)藥的提取難度，相應(yīng)的其檢測限也往往高于植物基質(zhì)。因此本研究將建立一種檢出限低、操作步驟簡單且能同時測定4種動物基質(zhì)中2種農(nóng)藥的檢測方法，為轉(zhuǎn)化CAC動物源產(chǎn)品中2種農(nóng)藥的殘留限量標準和優(yōu)化現(xiàn)行的殘留檢測方法標準奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 超高壓液相色譜儀（Waters ACQUITYTM）；串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB SCIEX API4000+）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（SENCO）；電子天平（梅特勒，精度0.01 g和0.000 1 g）；低速臺式離心機（上海安亭）；超純水機（優(yōu)普）；0.22 μm有機濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；WondaSep GC-e/NH2 SPE小柱（500 mg×6 mL）。

1.1.2 試劑 三唑酮標準品（丙酮；1 000 μg/mL；農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心）、三唑醇標準品（異丙醇；100 μg/mL；農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心）；甲醇、乙腈、甲苯、甲酸（色譜純；Fisher Scientific）；氯化鈉（分析純；廣州化學(xué)試劑廠）；超純水。

1.2 方法

1.2.1 試樣制備 雞蛋樣品：取適量新鮮的雞蛋，去殼，將蛋清和蛋黃攪拌均勻，密封標記，-18 ℃冷凍保存。

雞肉和豬肉樣品：去骨，包含脂肪含量小于10%的脂肪組織，用絞肉機絞碎，充分混勻，用四分法縮分至不少于500 g，作為試樣，裝入清潔容器內(nèi)，密封標記，-18 ℃冷凍保存。

牛奶（生乳）樣品：取不少于500 g代表性的牛奶（生乳）樣品，充分混勻，置于樣品瓶中，密封標記，4 ℃冰柜中避光保存。

1.2.2 試驗室分析 （1）提取。準確稱取5克雞蛋、雞肉、豬肉或牛奶樣品于25 mL離心管中，加入25 mL乙腈和5～10 g氯化鈉，振蕩提取30 min，4 000 r/min離心5 min，移取10 mL上清液于一個50 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干（40 ℃），用5 mL乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1，V ∶ V）重新溶解，待凈化。（2）凈化。將GC-e/NH2（500 mg，6 mL）固相萃取小柱預(yù)先用4 mL乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1，V ∶ V）淋洗，然后上樣，再用5 mL乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1，V ∶ V）洗脫2次，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸干（40 ℃）。用2 mL甲醇溶解定容，過0.22 μm有機濾膜后待測。（3）色譜分析。色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：甲醇；梯度洗脫：0～2 min，90%～15% A；2～4 min，15% A；4～5 min，15%～90%A；流速0.25 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

三唑酮和三唑醇的質(zhì)譜參數(shù)見表1和2。

1.2.3 方法驗證 根據(jù)歐盟《食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析的質(zhì)量控制和驗證程序指導(dǎo)文件SANCO/12571/2013》[23]，方法驗證包括線性、檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率和精度。

線性：首先使用甲醇分別配制10 μg/mL的三唑酮和三唑醇的標準儲備液，然后再使用甲醇稀釋標準儲備液配制三唑酮和三唑醇濃度一致的系列混合標準工作液，系列濃度依次為0.005 0，0.007 5，

0.010 0，0.050 0和0.100 0 μg/mL。分別稱取4種空白基質(zhì)，按照1.2.2的步驟進行提取和凈化，其中凈化過程最后用配制的系列混合標準工作液替代甲醇定容，得到三唑酮和三唑醇的系列混合基質(zhì)標準溶液，再上機測定，以進樣濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積均值（每個濃度3個重復(fù)）為縱坐標，繪制標準曲線，得到三唑酮和三唑醇在4種基質(zhì)中的0.005～0.1 μg/mL范圍內(nèi)基質(zhì)標準方程和相關(guān)系數(shù)。

檢測限（LOD）：用甲醇配制三唑酮和三唑醇的溶劑標準，然后按照1.2.2的儀器條件進樣，根據(jù)三唑酮和三唑醇選擇的定量離子峰高與基線峰高比值來逐級稀釋三唑酮和三唑醇的溶劑標準，將產(chǎn)生3倍噪音信號的（S/N=3）的三唑酮和三唑醇的溶劑標準濃度定為檢測限。

定量限（LOQ）：設(shè)定為三唑酮和三唑醇的最低添加濃度，且要低于或等于推薦的MRL值，且回收率和相對標準偏差要符合SANCO/12571/2013的要求。

回收率和精度：分別在4種基質(zhì)中添加三唑酮和三唑醇，添加濃度分別為在雞肉、雞蛋和牛奶中分別為0.005 0，0.007 5和0.010 0 mg/kg，豬肉中為0.005 0，0.007 5和0.020 0 mg/kg，其中三唑酮和三唑醇的濃度一致，每個濃度重復(fù)5次。然后按照1.2.2的分析方法測定，并根據(jù)建立的基質(zhì)標準方程，采用外標法計算回收濃度，根據(jù)SANCO/12571/2013的要求計算回收率和相對標準偏差（SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性

通過三唑酮和三唑醇的單一標準，分別確定三唑酮和三唑醇的保留時間分別為2.69 min和2.74 min，除了保留時間，按照SANCO/12571/2013對質(zhì)譜檢測方法的要求，每種農(nóng)藥還要分別選擇1種母離子和2個子離子（一個用于定性，一個用于定量）來確認目標物，本試驗中選擇的三唑酮母離子為m/z294.1，定量離子為m/z197.2，定性離子為m/z225.1，選擇的三唑醇的母離子為m/z296.2，定量離子為m/z70.2，定性離子為m/z99.2；且較標準品，基質(zhì)中各離子的豐度比在70%～130%之間。三唑酮和三唑醇在4種基質(zhì)中的選擇離子流圖和4種空白基質(zhì)的選擇離子流圖見圖1。

由于在離子化過程中，基質(zhì)會對儀器信號產(chǎn)生抑制或者增強效應(yīng)，因此為排除基質(zhì)干擾，本試驗統(tǒng)一選擇基質(zhì)標準方程對目標物進行定量。通過繪制基質(zhì)標準曲線得到三唑酮在雞蛋、雞肉、豬肉和牛奶中的基質(zhì)標準方程及相關(guān)系數(shù)分別為：Y=8.4×106x+1.04×104（r=0.999 9）、Y=7.59×106E+06x+1.24×104（r=0.999 5）、Y=8.4E×106+06x+1.29×104（r=0.999 7）、Y=8.99×106E+06x+1.03×104（r=0.999 9）；三唑醇在雞蛋、雞肉、豬肉和牛奶中的基質(zhì)標準方程及相關(guān)系數(shù)分別為：Y=1.62×107E+07x+8.0E+03（r=1.000 0）、Y=1.40×107E+07x+1.97×104（r=0.999 8）、Y=1.45×107E+07x+3.01×104（r=0.999 3）、Y=1.42×107E+07x+2.89×104（r=0.999 3）；這些數(shù)據(jù)表明2種農(nóng)藥在4種基質(zhì)中，在0.005～0.1 μg/mL的濃度范圍內(nèi)定量離子的豐度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 檢測限和定量限

按照1.2.3中對檢測限的要求和對定量限的設(shè)定，最終三唑酮和三唑醇的檢測限皆為0.001 μg/mL，三唑酮和三唑醇在檢測限水平（0.001 μg/mL）的選擇離子流圖見圖2；三唑酮和三唑醇在4種基質(zhì)中的定量限皆為0.005 mg/kg，三唑酮和三唑醇在4種基質(zhì)中定量限水平（0.005 mg/kg）的選擇離子流見圖3。

2.3 回收率和精度

按照SANCO/12571/2013對質(zhì)譜檢測方法的要求，分別選擇定量限、MRL值以及二者之間的任意水平作為添加濃度，每個濃度重復(fù)5次，分別計算每種化合物在每種基質(zhì)中的添加回收率和相對標準偏差，結(jié)果表明，三唑酮在4種基質(zhì)中的平均回收率為81.1%～110.6%，相對標準偏差為1.4%～7.7%，三唑醇在4種基質(zhì)中的平均回收率為75.1%～102.9%，相對標準偏差為1.2%～7.9%，滿足SANCO/12571/2013要求，具體數(shù)據(jù)見表3。

3 討論與結(jié)論

方法驗證的結(jié)果來看，建立的三唑酮和三唑醇在4種動物源基質(zhì)中分析方法的線性，精確度和準確度都達到SANCO/12571/2013的要求。

雖然目前已經(jīng)有多篇文獻報道了植物基質(zhì)中三唑酮或三唑醇殘留的分析方法，但目前尚未檢索到關(guān)于動物基質(zhì)雞肉、豬肉和雞蛋中三唑酮和三唑醇的殘留分析方法，動物基質(zhì)不同于植物基質(zhì)，其含有較多的脂肪和蛋白質(zhì)，大大增加了三唑酮和三唑醇這類脂溶性農(nóng)藥的提取難度，王敬等[20]人論述到動物基質(zhì)一般具有較強的基質(zhì)效應(yīng)，為減少基質(zhì)效應(yīng)，需要更多的凈化步驟，相應(yīng)的使目標物的定量限增高。王敬等[20]建立的測定牛奶和奶粉中三唑酮和三唑醇殘留的分析方法，使用乙腈提取，石墨化炭黑/氨基固相萃取柱凈化，乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1）淋洗，前處理基本和本研究類似，但其使用的氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對三唑酮的響應(yīng)并不如本研究使用的超高壓液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜靈敏，其三唑酮的定量限為9.29 μg/kg，本研究為5 μg/kg。沈偉健等[21]建立的利用氣相色譜-負化學(xué)離子源質(zhì)譜測定牛肉中三唑醇的分析方法，雖然定量限為3 μg/kg，但要使用正己烷飽和乙腈（含1%冰醋酸）溶液提取80 min，太耗費時間。鄭軍紅等[22]建立的液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定牛奶中三唑醇的分析方法，使用乙腈提取，ENVITM-18固相萃取柱凈化，前處理步驟簡易程度與本研究類似，檢出限為2.64 μg/kg，本研究為1 μg/L，因此靈敏度不如本研究，且未同時測定三唑酮。

國際食品法典委員會CAC（Codex Alimentarius Commission）制定的三唑酮和三唑醇在豬肉、雞肉、牛奶和雞蛋中的殘留限量分別為0.02，0.01，0.01，

0.01 mg/kg，且殘留定義為三唑酮和三唑醇之和，即在對動物樣品的殘留檢測過程中2種化合物都要測定，且殘留結(jié)果為2種化合物殘留量之和?，F(xiàn)行的檢測動物源產(chǎn)品中三唑酮和三唑醇的國家標準或者行業(yè)標準只有4個，即GB/T 19650-2006、GB/T 23210-2008、GB/T 20772-2008和SN/T 2232-2008，而國標GB/T19650-2006僅制定了豬肉和雞肉中三唑醇和三唑酮的檢測方法且定量限為三唑酮0.050 0 mg/kg和三唑醇0.075 0 mg/kg，國標GB/T 23210-2008僅制定了牛奶中三唑醇和三唑酮的檢測方法且定量限為三唑酮0.066 7 mg/L和三唑醇0.100 0 mg/L，因此依據(jù)國標GB/T19650-2006和GB/T 23210-2008不能檢測雞蛋中的三唑酮和三唑醇含量，雖可以檢測豬肉、雞肉和牛奶中的三唑酮和三唑醇含量，但定量限都要高于CAC設(shè)置的MRL水平；出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 2232-2008僅制定了牛肉中三唑醇的檢測方法且定量限為0.005 mg/kg，由于不同基質(zhì)對目標物的干擾不同，因此也不能直接利用該方法同時檢測豬肉、雞肉、雞蛋和牛奶中2種目標農(nóng)藥的殘留水平；國標GB/T 20772-2008制定了豬肉和雞肉中三唑醇和三唑酮的檢測方法且定量限為三唑酮0.002 mg/kg和三唑醇0.004 mg/kg，雖然該檢測標準滿足同時檢測雞肉和豬肉中三唑酮和三唑醇的含量且定量限低于CAC設(shè)置的MRL水平，但是仍不能檢測牛奶和雞蛋中2種農(nóng)藥的殘留水平，而且該標準需要使用繁瑣的凝膠滲透色譜來凈化樣品，每個樣品凈化時間達到40 min，使檢測效率大大降低；由此可見，目前的國標或者行業(yè)標準對同時定量檢測動物源產(chǎn)品雞肉、豬肉、雞蛋和牛奶中的三唑酮和三唑醇存在靈敏度低，檢測效率低或/和兼容度不夠的問題，而本研究建立的檢測方法不僅靈敏度滿足CAC要求，而且操作步驟簡單，耗時短，對大批量樣品來說大大提升了檢測效率，而且同時滿足4種基質(zhì)的檢測要求，為以后動物源樣品中2種農(nóng)藥的檢測以及檢測方法標準的更新提供了參考。

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