李傳明 韓光杰 劉琴 祁建杭 徐健

摘要：【目的】明確蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Bt-8的菌株生物特征及其殺蟲活性，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考?！痉椒ā客ㄟ^LB培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察3株蘇云金桿菌Bt-8、Bt2671和Bt7-9菌株生長特征，并比較分析其內(nèi)生質(zhì)粒和晶體蛋白的種類。發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)分離3株菌株的晶體蛋白，通過生物活性測定和國家標(biāo)準(zhǔn)中描述的方法分析毒素蛋白濃度和生物效價及殺蟲譜?！窘Y(jié)果】Bt-8具有典型的蘇云金桿菌培養(yǎng)特征，營養(yǎng)生長后期形成菱形至橢圓形晶體蛋白，但孢子穩(wěn)定時間較短，容易二次萌發(fā)。Bt-8攜帶24、16、8 和7 kb 4種質(zhì)粒，大分子晶體蛋白基因主要為cry1Ac和cry1Ab。殺蟲活性分析結(jié)果表明，Bt-8培養(yǎng)活菌數(shù)低于原分離菌株Bt2671，但晶體蛋白代謝量極顯著提高（P<0.01），生物效價較Bt2671提高30.4%，對小菜蛾、稻縱卷葉螟和茶尺蠖等多種鱗翅目害蟲具有廣譜殺蟲活性?！窘Y(jié)論】Bt-8菌株較原生產(chǎn)菌株Bt2671的生物效價高，產(chǎn)毒素蛋白能力較強，殺蟲譜較廣，具有開發(fā)高含量Bt制劑的潛力。

關(guān)鍵詞： 蘇云金桿菌；發(fā)酵；培養(yǎng)特性；殺蟲活性

中圖分類號： S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）12-2072-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to investigate biological characteristics and insecticidal activity of Bacillus thuringiensi（Bt） strain Bt-8， in order to provide a reference for industrial production. 【Method】The cultural characteristics， endogenous plasmids and insecticidal crystallin proteins（ICPs） varieties of B. thuringiensis strains Bt-8， Bt2671 and Bt7-9 were observed and analyzed after cultured with LB medium. Bt-8， Bt2671 and Bt7-9 were cultured in fermentative medium， then ICPs were isolated， and its insecticidal spectrum and relation between concentration and bio-potency were analyzed by biological activity assay and national standard detection method of toxin proteins. 【Result】Results showed that， Bt-8 had typical cultural characteristics of B. thuringiensis， ICPs were diamond or oval-shaped in the late stage of vegetative growth. However， Bt-8 was easy to regermination because of shorter stability time of spore. Bt-8 had four types of endogenous plasmids with the length of 24， 16， 8 and 7 kb， and the main genes of ICPs included cry1Ac and cry1Ab. Insecticidal activity analysis showed that， survival number of Bt-8 was significantly lower than that of Bt2671， whereas metabolism yield of ICPs was significantly increased. The bio-potency of Bt-8 was increased by 30.4% compared with that of Bt2671. Bt-8 had a widespread insecticidal spectrum against lepidopterous pest， such as Plutella xylostella， Ectropis obliqua Prout， Cnaphalocrocis medinalis and so on. 【Conclusion】The bio-potency， insecticidal spectrum and toxin proteins-producing ability of Bt-8 are significantly higher than those of Bt2671， therefore， it has potential for development of new Bt preparations with high content.

Key words： Bacillus thuringiensis； fermentation； cultural characteristics； insecticidal activity

0 引言

【研究意義】“十三五”農(nóng)業(yè)發(fā)展中要求藥肥減量施用，而蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）作為應(yīng)用最廣泛的微生物農(nóng)藥將發(fā)揮重要作用。目前市場上蘇云金桿菌生物效價最高的為32000 U/mg可濕性粉劑，因此篩選高效價的菌株對提高其作用效果，控制生產(chǎn)成本具有重要作用；同時，明確篩選菌株的作用特性可為菌株篩選提供方向，并為后期發(fā)酵培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘇云金桿菌是在自然界中廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌，由日本細(xì)菌學(xué)家石渡繁胤于1901年在蠶蛾尸體中首次發(fā)現(xiàn)，1911年德國人貝爾奈再次分離該菌并正式命名。蘇云金桿菌在其營養(yǎng)生長后期代謝產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白（ICPs）對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、同翅目昆蟲及線蟲等具有特異性毒殺作用，對人畜安全，不污染環(huán)境，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、貯藏及衛(wèi)生等多種害蟲的防治。同時，利用一些外源物質(zhì)，如熒光增白劑、桿狀病毒、蠟質(zhì)芽孢桿菌等也可以提高其應(yīng)用范圍及效果（陳在佴等，2003；李怡萍等，2013； Han et al.，2015）。目前已報道的蘇云金桿菌包含82個亞種（Lecadet et al.，1999），其中以對鱗翅目害蟲高效的庫斯塔克亞種（B. thuringiensis subsp. kurstaki）的應(yīng)用及研究最廣泛。蘇云金桿菌庫斯塔克亞種是一類對菜蛾科害蟲具有高度毒殺活性的菌株，其殺蟲活性主要取決于ICPs的表達(dá)量。發(fā)酵培養(yǎng)基一定程度上影響同一菌株ICPs的代謝，而分離篩選ICPs高表達(dá)量的蘇云金桿菌菌株是工業(yè)生產(chǎn)中提高發(fā)酵水平、增強產(chǎn)品毒力效果的主要途徑。為了提高菌株的殺蟲活性或擴(kuò)大殺蟲譜，包括殺線蟲菌株YC-10、殺蝗蟲菌株Bt7、殺甜菜夜蛾等菌株GS8等多株蘇云金桿菌菌株被篩選鑒定（朱文等，1995；劉廷輝等，2009；金娜等，2015）?！颈狙芯壳腥朦c】本研究前期從工業(yè)生產(chǎn)菌株Bt2671中分離到新菌株Bt-8，該菌株較原始菌株毒力有顯著提高，但尚未對其培養(yǎng)特征、殺蟲活性蛋白特性等進(jìn)行研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以蘇云金桿菌庫斯塔克亞種（B. thuringiensis subsp. kurstaki）菌株Bt2671、鲇澤亞種（Subsp. aizawai 7-9）菌株Bt7-9為對比材料，研究新菌株Bt-8的生物學(xué)特性、毒素基因種類及蛋白表達(dá)水平、殺蟲活性及殺蟲譜，為菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株及原藥 蘇云金桿菌庫斯塔克亞種（B. thuringiensis subsp. kurstaki）菌株Bt2671、鲇澤亞種（Subsp. aizawai）菌株Bt7-9均由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所應(yīng)用微生物實驗室保存，蘇云金桿菌Bt-8由Bt2671菌株經(jīng)多年分離篩選獲得。32000 U/mg蘇云金桿菌原藥購自福建浦城綠安生物農(nóng)藥有限公司。

1. 1. 2 供試?yán)ハx 小菜蛾（Plutella xylostella）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、甜菜夜蛾（S. exigua）、茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）和稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）均由實驗室常年飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲和試驗溫度為（25±1）℃，相對濕度75%，光照時間14 h。斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、茶尺蠖幼蟲置于直徑10 cm的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，用麥胚粉、瓊脂等配制的人工飼料飼養(yǎng)，取2齡初幼蟲供測定（劉琴等，2015）。稻縱卷葉螟飼養(yǎng)參照劉琴等（2013）的方法，取2齡中期幼蟲供測定。小菜蛾幼蟲使用油菜苗飼養(yǎng)，取3齡初幼蟲供測定。

1. 1. 3 培養(yǎng)基配方 蘇云金桿菌LB培養(yǎng)基配方：每升培養(yǎng)基含蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g（固體配方每升另加14.00 g瓊脂粉）。

蘇云金桿菌實驗室發(fā)酵配方：每升培養(yǎng)基含豆餅粉22.50 g，玉米漿5.00 g，淀粉12.50 g，MgSO4 1.00 g，CaCO3 2.00 g，NaCl 2.00 g，KH2PO4 1.00 g，ZnSO4 0.15 g，pH 7.2。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 蘇云金桿菌菌株形態(tài)觀察及特性分析 挑取菌株Bt-8、Bt2671和Bt7-9單菌落在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，以1∶50將上述菌株轉(zhuǎn)接至錐形瓶中，每隔2 h測定OD600和pH，直至形成穩(wěn)定的孢子。采用普通光學(xué)顯微鏡（自動成像系統(tǒng)）觀察菌株胞體、芽孢及伴孢晶體的形態(tài)，并拍照記錄。將各菌株孢子液梯度稀釋后取1 mL加入培養(yǎng)皿中，加入溶解的LB固體培養(yǎng)基（50 ℃左右）25 mL輕輕搖勻，待自然冷卻后，置34 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，檢查菌落并計數(shù)。計算方法：菌數(shù)（CFU/mL）=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1. 2. 2 蘇云金桿菌菌株內(nèi)生質(zhì)粒提取 按照劉晶晶等（2008）的方法提取蘇云金桿菌內(nèi)生質(zhì)粒，瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。

1. 2. 3 蘇云金桿菌菌株Cry蛋白基因檢測 參照張杰等（2000）部分cry基因通用引物的設(shè)定，測定Bt-8內(nèi)cry基因種類。

1. 2. 4 晶體蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 參照王瑛等（1980）差速離心法提取蘇云金桿菌晶體蛋白。參照《分子克隆實驗指南》（薩姆布魯克和拉塞爾，2006）制備SDS-PAGE凝膠，分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為4%。電泳結(jié)束后，晶體蛋白種類參照Swain和Ross（1995）的方法進(jìn)行銀染檢測。晶體蛋白濃度的檢測參照《分子克隆實驗指南》（薩姆布魯克和拉塞爾，2006）進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，經(jīng)脫色后拍照。

1. 2. 5 晶體蛋白含量測定 以32000 U/mg蘇云金桿菌原藥為標(biāo)準(zhǔn)品，按照蘇云金桿菌可濕性粉劑檢測標(biāo)準(zhǔn)（國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19567.3-2004），稱取20 mg樣品梯度稀釋后測定其濃度及灰度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取Bt-8、Bt2671和Bt7-9發(fā)酵培養(yǎng)液各200 μL，加入20 μL NaOH（1 mol/L）裂解5 min后加入80 μL 3×上樣緩沖液，混勻煮沸后加樣10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果使用Image J 計算灰度。

1. 2. 6 蘇云金桿菌菌株生物活性測定 挑取Bt-8、Bt2671和Bt7-9單菌落，使用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)至晶體形成。以上述菌液為原液，用含0.5 mL/L吐溫-100無菌水依次梯度稀釋成5個濃度。各指定濃度分別添加10 μL菌液至人工飼料中或100 mL菌液浸潤葉片，幼蟲置于培養(yǎng)皿中處理。每處理3次重復(fù)，每次30頭幼蟲。連續(xù)觀察2 d（小菜蛾、茶尺蠖和稻縱卷葉螟）至4 d（甜菜夜蛾和斜紋夜蛾），統(tǒng)計死亡率，并添加新鮮飼料。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用DPS 7.05數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，多重比較方法采用Duncans新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2. 1 Bt-8菌株一般生物學(xué)特性

不同Bt菌株在LB培養(yǎng)基中的培養(yǎng)性狀觀察結(jié)果表明，篩選菌株Bt-8在LB培養(yǎng)基中具有典型的蘇云金桿菌特征，培養(yǎng)后期細(xì)胞的一端形成橢圓形孢子，孢子脫落并釋放出菱形至橢圓形晶體蛋白（圖1）。3株菌株在培養(yǎng)24 h后OD600達(dá)最大值，后期趨于穩(wěn)定，pH經(jīng)歷先抑后升的過程；但Bt-8菌株在培養(yǎng)30 h后OD600有明顯下降，pH也從8.0降至7.2（圖2）。

2. 2 Bt-8菌株內(nèi)生質(zhì)粒及晶體蛋白分析結(jié)果

3株Bt菌內(nèi)生質(zhì)粒瓊脂糖電泳結(jié)果（圖3-A）表明，Bt-8與Bt2671均含有24、16、8和7 kb 4種質(zhì)粒，而Bt7-9不含16 kb質(zhì)粒，另含有大于23 kb的質(zhì)粒。通過純化3菌株晶體蛋白，SDS-PAGE電泳通過銀染后發(fā)現(xiàn)其均包含130和65 kD兩種晶體蛋白（圖3-B）。以Bt-8菌株質(zhì)粒為模板，利用cry基因通用引物，擴(kuò)增出兩條cry基因，測序分析結(jié)果顯示為cry1Ac和cry1Ab。

2. 3 Bt-8對小菜蛾的殺蟲活性分析結(jié)果

通過生物活性測定，Bt-8、Bt2671和Bt7-9菌株搖瓶發(fā)酵液對小菜蛾3齡幼蟲的半致死濃渡（LC50）分別為1.0179、1.3271和1.4782 mg/mL（表1）。以32000 U/mg蘇云金桿菌為標(biāo)準(zhǔn)樣品測算3株Bt菌的生物效價分別為4272.3、3276.9和2942.0 U/mg，Bt-8較Bt2671的生物效價高30.4%。按照蘇云金桿菌毒素蛋白國家檢測標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19567.3-2004），以32000 U/mg蘇云金桿菌為標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1188x-1008，R2=0.984）（圖4），測定Bt-8、Bt2671和Bt7-9的晶體蛋白含量分別為5.40、4.02和3.95 μg/mL，Bt-8菌株代謝產(chǎn)生毒素蛋白含量極顯著高于Bt2671和Bt7-9（P<0.01）（圖5）；3株菌株中以Bt2671含菌量最高（2.23×109 CFU/mL），Bt-8與Bt7-9無顯著差異（P<0.05）（圖6），說明菌株毒力高低與代謝蛋白含量呈正相關(guān)。

2. 4 Bt-8的殺蟲譜

以小菜蛾3齡幼蟲，茶尺蠖、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾和稻縱卷葉螟2齡幼蟲為供試?yán)ハx，測定Bt-8的殺蟲活性。生物活性測定結(jié)果（表2）顯示，Bt-8對小菜蛾（菜蛾科）具有較高的殺蟲活性，LC50為1.0179 mg/mL，對稻縱卷葉螟（草螟科）和茶尺蠖（尺蠖蛾科）也具有較好的毒殺效果，LC50分別為2.1757和9.2639 mg/mL，但對斜紋夜蛾（夜蛾科）和甜菜夜蛾（夜蛾科）效果不佳。

3 討論

原菌株基因改造、發(fā)酵配方優(yōu)化及新菌株篩選是提高蘇云金桿菌毒力水平的重要途徑（吳繼星等，1994；姚江等，1999；韓光杰等，2014），然而在實際應(yīng)用中，受轉(zhuǎn)基因微生物應(yīng)用研究基礎(chǔ)薄弱、轉(zhuǎn)基因微生物防效不理想、轉(zhuǎn)基因風(fēng)險評估機(jī)制缺乏等影響，仍以配方優(yōu)化和菌株篩選為主要研究途徑。通過正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計的方法，可篩選出優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基提高蘇云金桿菌的生物效價（吳繼星等，1994；關(guān)雄等，1998），但這主要是增加了菌株的孢子數(shù)。為了生產(chǎn)更高效價的生物產(chǎn)品，亟需篩選高毒力的蘇云金桿菌新菌株。Bt2671于1991年分離成為發(fā)酵菌株，其各項生理生化指標(biāo)均較穩(wěn)定，但效價一直處于中等水平，發(fā)酵成本偏高，為了獲得穩(wěn)定的高效價菌株，近年來本課題組通過蟲體分離、發(fā)酵培養(yǎng)、性狀穩(wěn)定性測試、配方優(yōu)化等方法，于2013年成功分離了Bt-8菌株并作為生產(chǎn)應(yīng)用主要菌株，該菌株較Bt2671生物效價提高了30.4%，顯著降低了發(fā)酵成本，為生產(chǎn)高效價的蘇云金桿菌菌劑提供了菌源基礎(chǔ)。

Bt-8孢子穩(wěn)定周期相對于Bt2671較短，并能很快二次萌發(fā)，因此在發(fā)酵中要及時關(guān)注晶體的形成情況。Bt-8的內(nèi)生質(zhì)粒和晶體種類與Bt2671無差別，但發(fā)酵液對小菜蛾的毒力有明顯差異，而這兩種菌株的發(fā)酵上清液對小菜蛾均無明顯毒力，這種差異主要表現(xiàn)在孢子數(shù)和晶體蛋白含量。Bt-8、Bt2671和Bt7-9 3株Bt菌生物效價和毒素蛋白含量呈正相關(guān)，然而Bt-8的孢子數(shù)顯著低于Bt2671，但晶體蛋白含量顯著高于Bt2671，原因可能是Bt-8的產(chǎn)毒素蛋白能力極強于Bt2671。本研究發(fā)酵培養(yǎng)基可能不是Bt-8的最優(yōu)配方，因此后期應(yīng)加強配方的優(yōu)化試驗，以提高Bt-8的菌數(shù)，增強其毒力水平。

對Bt-8殺蟲譜的研究發(fā)現(xiàn)，蘇云金桿菌對鱗翅目多數(shù)昆蟲有效，但對夜蛾科的昆蟲防效較低（如甜菜夜蛾、斜紋夜蛾）。牛桂蘭等（2002）分離的蘇云金桿菌WY-190對甜菜夜蛾表現(xiàn)出較高的毒力，但試驗供試?yán)ハx為初孵幼蟲。本研究供試?yán)ハx為2齡幼蟲，Bt-8對其防效較差，可能是蟲齡差異或菌株專一性差異所造成。因此，針對一些較難防治的害蟲，應(yīng)提前用藥，以提高藥物的敏感性，同時應(yīng)加大害蟲專性微生物的篩選工作。楊瓊等（2013）分離篩選的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）和類芽孢桿菌（Paenibacillus cookie）菌體沉淀破碎液對甜菜夜蛾也顯示了較高的殺蟲效果，其主要作用因子為胞內(nèi)蛋白。

昆蟲中腸圍食膜是昆蟲免疫的第一道屏障，其主要成分為腸粘蛋白、幾丁質(zhì)蛋白、幾丁質(zhì)纖維網(wǎng)（Wang and Granados，2001）。本課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)菌株Bt2671代謝產(chǎn)生的毒素蛋白可以改變甜菜夜蛾中腸圍食膜結(jié)構(gòu)，使圍食膜變薄，另外圍食膜小分子29 kD蛋白也被完全降解，顯示了類似增效蛋白的特性（劉琴等，2011）。這種特性與顆粒體病毒的增效蛋白有何區(qū)別，仍是需要研究的內(nèi)容。本研究的Bt-8菌株來源于Bt2671，是否含有類似增效蛋白基因序列也有待進(jìn)一步研究。隨著蘇云金桿菌工程菌基礎(chǔ)研究的加強，多種毒素蛋白或活性物質(zhì)被構(gòu)建進(jìn)同一菌株，以提高菌株的殺蟲譜和作用效果也將今后的研究方向。但是，菌株篩選工作仍要繼續(xù)，新的毒素蛋白或活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)以新菌株為基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究中Bt-8菌株較原生產(chǎn)菌株Bt2671生物效價提高30.4%，具有較大的開發(fā)優(yōu)勢。通過對菌株的生物特性分析發(fā)現(xiàn)Bt-8菌株生長較快，容易二次萌發(fā)，產(chǎn)毒素蛋白能力較強。使用通用發(fā)酵配方培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Bt-8孢子數(shù)低于Bt2671，故在后期應(yīng)通過配方優(yōu)化提高其孢子產(chǎn)量和毒素蛋白含量。Bt-8菌株具有較廣的殺蟲譜，對小菜蛾、稻縱卷葉螟和茶尺蠖均表現(xiàn)出較好的防治效果，但對夜蛾科的甜菜夜蛾和斜紋夜蛾防治效果較差。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）