孟衡玲 張薇 盧丙越 蘇一蘭 薛春麗

摘要：【目的】克隆鐵皮石斛中查爾酮合酶（CHS）基因，分析其基本生物學(xué)信息及組織表達(dá)特異性，為進(jìn)一步研究CHS基因在鐵皮石斛中的表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其在鐵皮石斛中的功能打下理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎描F皮石斛轉(zhuǎn)錄組序列與NCBI同源序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物克隆鐵皮石斛CHS基因的cDNA全長(zhǎng)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量表達(dá)分析不同生長(zhǎng)年限、不同組織部位中CHS基因的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】鐵皮石斛CHS基因cDNA編碼區(qū)1188 bp，編碼395個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)KT783451，分子量為43.2 kD，理論等電點(diǎn)6.05。鐵皮石斛GHS氨基酸序列與同屬植物金釵石斛（Dendrobium nobile）的CHS氨基酸序列同源性最高，達(dá)99%，與非同科植物歐洲大葉楊（Populus trichocarpa）、巨桉（Eucalyptus grandis）和紫玉蘭（Magnolia liliiflora）等植物的同源性在83%左右。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬非分泌蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，為非跨膜結(jié)構(gòu)的親水性不穩(wěn)定蛋白。CHS基因在1年生鐵皮石斛葉片中的表達(dá)量最高，隨著植株年齡的增長(zhǎng)，葉片中CHS基因的表達(dá)量降低，莖中的表達(dá)量升高?！窘Y(jié)論】鐵皮石斛CHS基因早期主要參與激素運(yùn)輸和器官形態(tài)建成，后期主要參與類黃酮物質(zhì)合成。

關(guān)鍵詞： 鐵皮石斛；查爾酮合成酶；基因克隆；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)： S567.239；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）12-2015-05

Abstract：【Objective】The present study cloned chalcone synthase（CHS） gene and analyzed its basic biological information and tissue-specific expression in Dendrobium officinale， in order to lay a theoretical basis for further research on the function and expression regulation mechanism of CHS gene in D. officinale. 【Method】Comparing conserved sequence with NCBI homologous sequence， real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to analyze CHS gene expression in different tissues at different growth years based on cDNA full length of design-primer-cloned CHS gene in conserved domain. 【Result】The coding region of CHS gene in D. officinale was 1188 bp encoding 395 amino acids， molecular weight was 43.2 kD， theoretical isoelectric point 6.05， GenBank accession number KT783451. In terms of amino acid sequence，CHS in D. officinale showed the highest homology（99%） with that in Dendrobium nobile， its same generic plant. The homology between CHS sequence in D. officinale and its non-family plants Populus trichocarpa， Eucalyptus grandis and Magnolia liliiflora was around 83%. The encoded protein of CHS gene belonged to non-secreted protein which was located in cytoplasmic matrix. It was hydrophilic unstable protein with non-transmembrane structure. The expression level of CHS gene was the highest in one-year leaves of D. officinale. As growth year increased， the expression level of CHS gene decreased in leaves， but increased in stems. 【Conclusion】CHS gene in D. officinale is mainly involved in auxin transport and organ morphogenesis at early stage and participats in flavonoid biosynthesis at late stage.

Key words： Dendrobium officinale； chalcone synthase； gene cloning； real-time fluorescence quantitative PCR

0 引言

【研究意義】黃酮二糖碳苷類化合物是自然界中抗氧化作用最強(qiáng)的天然化合物之一，具有抑制活性氧和清除自由基的作用，在鐵皮石斛（Dendrobium officinale）的莖、葉和花中均有分布且含量豐富（周桂芬和呂圭源，2012）。查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）是植物次生代謝途徑中黃酮類物質(zhì)合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，參與類黃酮合成（康亞蘭等，2014；田愛(ài)梅等，2014）。因此，克隆鐵皮石斛CHS基因并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，對(duì)研究CHS基因在鐵皮石斛中的表達(dá)和黃酮類物質(zhì)的合成機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CHS基因是一個(gè)較大的基因家族，在植物不同類群中CHS基因較保守，科之間存在70%～90%的氨基酸同源性（Lanz et al.，1991）。目前，已從玉米（Franken et al.，1991）、蘭花（Liew et al.，1998）、擬南芥（Saslowsky et al.，2000）和高粱（Lo et al.，2002）等600多種植物中克隆獲得CHS基因。研究表明，CHS基因不僅參與類黃酮的合成，還參與防輻射、抗病等生理活動(dòng)，在植物體中的表達(dá)具有器官特異性，可能與器官形態(tài)建成、功能分化有一定聯(lián)系（蔣明和曹家樹(shù)，2007；劉濤等，2013；Yan et al.，2015；巫建華等，2016）。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于鐵皮石斛CHS基因表達(dá)和功能的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，限制了對(duì)鐵皮石斛黃酮合成及CHS基因功能的深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆鐵皮石斛CHS基因，分析其基本生物學(xué)信息及組織表達(dá)特異性，為研究CHS基因在鐵皮石斛中的表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其在鐵皮石斛中的功能打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛由云南紅河州巨峰石斛種植有限公司提供，以其葉片為材料提取總RNA并進(jìn)行CHS基因克隆。以1～3年生鐵皮石斛的根、莖、葉為材料分析不同生長(zhǎng)年限、不同組織部位中CHS基因的表達(dá)水平。大腸桿菌DH5α由云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自備，pMD 18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，總RNA提取試劑盒、DNA消化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript III First- Strand Synthesis SuperMix及qRT-PCR反應(yīng)試劑PowerUpTM SYBR Green Master Mix購(gòu)自Life Technologies公司。

1. 2 鐵皮石斛CHS基因克隆

用試劑盒提取鐵皮石斛總RNA，進(jìn)行DNA消化，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得鐵皮石斛cDNA模板。根據(jù)GenBank中CHS基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)擴(kuò)增特異性引物F1（5'-ATGGCGCCGCCGGCAATGGAAGAGA-3'）和R1（5'-TCACACCGCACCAGCAATCGGAACG-3'），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增獲得目的片段克隆到pMD18-T載體上，送至華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序。

1. 3 鐵皮石斛CHS基因的生物信息學(xué)分析

采用Computer pI/Mw Tool在線軟件進(jìn)行蛋白分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)預(yù)測(cè)；ExPASy ProtParam tool預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸組成，TMHMM的Transmembrane Prediction server預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，NCBI結(jié)構(gòu)分析軟件進(jìn)行CHS基因結(jié)構(gòu)域分析。

1. 4 鐵皮石斛CHS基因的qRT-PCR分析

根據(jù)已獲得的鐵皮石斛CHS基因序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR擴(kuò)增引物CHS Forward（5'-GGTTCTCGTCGTTTG TTCAG-3'）和CHS Reverse（5'-TCGTTCAGTAGTCAAGTCAGG-3'），目的片段148 bp。根據(jù)金釵石斛內(nèi)參基因GAPDH（GQ250049.1）序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物GAPDH Forward（5'-GTGCCAAGAAGGTTATCATCTCTG-3'）和GAPDH Reverse（5'-CTCATGCTCATTAACACCAACAAC-3'），目的片段74 bp。使用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析，每個(gè)樣本重復(fù)3次，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后從60 ℃升高到98 ℃獲取熔解曲線。

2 結(jié)果與分析

2. 1 鐵皮石斛CHS基因全長(zhǎng)克隆

2. 1. 1 鐵皮石斛總RNA提取及CHS基因全長(zhǎng)擴(kuò)增 經(jīng)SMA4000超微量分光光度計(jì)（Merinton）檢測(cè)，提取的鐵皮石斛總RNA純度高，OD260/280在1.8～2.0。以鐵皮石斛cDNA為模板，F(xiàn)1/R1為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一條約1200 bp的特異性條帶（圖1），將擴(kuò)增片段純化回收，克隆到pMD18-T載體上，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序。結(jié)果表明，鐵皮石斛CHS基因cDNA編碼區(qū)共1188 bp，編碼395個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KT783451。CHS基因CDS序列中A+T含量為56.58%，G/C含量為43.42%，A和T的含量明顯高于G和C的含量。

2. 1. 2 鐵皮石斛CHS基因同源性分析 采用MEGA 5.0軟件UPGMA法構(gòu)建基于CHS氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2），NCBI BLASTp分析結(jié)果顯示，鐵皮石斛CHS氨基酸序列與同屬植物金釵石斛（Dendrobium nobile）CHS氨基酸序列一致性最高，其同源性達(dá)99%，與歐洲大葉楊（Populus trichocarpa）、巨桉（Eucalyptus grandis）和紫玉蘭（Magnolia liliiflora）等植物的CHS氨基酸序列同源性在83%左右，說(shuō)明鐵皮石斛CHS基因的保守性較高。

2. 1. 3 鐵皮石斛CHS基因的生物信息學(xué)分析 對(duì)CHS基因編碼蛋白進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該基因蛋白分子量為43.2 kDa，理論等電點(diǎn)為6.05，不穩(wěn)定系數(shù)為45.59。CHS蛋白氨基酸中，亮氨酸所占比例最高，為10.9%。TMHMM的Transmembrane Prediction server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CHS蛋白為非跨膜結(jié)構(gòu)親水性不穩(wěn)定蛋白，無(wú)信號(hào)肽，定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。NCBI結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白序列具有多個(gè)活性位點(diǎn)，5個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，包括有N-末端結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域和聚酮合酶結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2. 2 鐵皮石斛CHS基因的定量表達(dá)分析結(jié)果

將1年生根的表達(dá)量設(shè)為對(duì)照（2-△△Ct定義為1），從圖4可看出，鐵皮石斛中CHS基因的表達(dá)水平在不同生長(zhǎng)年限、不同組織部位間差異明顯。方差分析結(jié)果表明，CHS基因在1年生葉中的表達(dá)量最高，與1年生和3年生莖中的表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>0.05），2年生和3年生葉中的表達(dá)量最低，僅為1年生葉中表達(dá)的10%左右。CHS基因在不同生長(zhǎng)年限根中的表達(dá)量差異較小，其中2年生根的表達(dá)量顯著高于1年生和3年生根（P<0.05）。不同生長(zhǎng)年限、不同組織部位中鐵皮石斛CHS基因表達(dá)量排序?yàn)椋?年生葉>1年生莖>3年生莖>2年生根>1年生根>3年生根>2年生莖>3年生葉>2年生葉。

3 討論

CHS超基因家族屬于生物聚酮合酶（Polyketide synthases，PKS）中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的類型，即III型聚酮合酶類（Zhan，2009；Abe and Morita，2010）。III型聚酮合酶類可催化多種聚酮化合物的生物合成，這些聚酮化合物具有抗菌、消炎、提高人體免疫力和抗癌等藥理功效（Jez et al.，2001），在植物器官著色（田鵬等，2015）、病蟲(chóng)害防護(hù)和紫外輻射抵御（Abe and Morita，2010）等方面起著非常重要的作用。CHS是超基因家族中的核心酶，也是目前研究最透徹的酶，大量研究主要集中于CHS對(duì)花色素合成的調(diào)節(jié)（李冬梅等，2012；張?jiān)奇玫龋?013；康亞蘭等，2014；田愛(ài)梅等，2014；王旭等，2014），但在植物生長(zhǎng)發(fā)育與代謝途徑方面的研究較少。因此，對(duì)III型聚酮合成酶，特別是對(duì)其整個(gè)超基因家族的深入研究可為尋找新型藥物、提升植物本身營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成和促進(jìn)作物的遺傳改良等提供新的途徑（包穎等，2015）。

本研究克隆了鐵皮石斛CHS基因cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)CHS基因在不同生長(zhǎng)年限、不同組織部位進(jìn)行實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析。鐵皮石斛CHS基因編碼區(qū)序列高度保守，氨基酸序列與同屬金釵石斛、細(xì)莖石斛的同源性高達(dá)99%。定量表達(dá)分析結(jié)果表明，CHS基因在1年生組織中的相對(duì)表達(dá)水平較高，但在2年生和3年生鐵皮石斛葉片中的表達(dá)量很低，說(shuō)明鐵皮石斛CHS基因的表達(dá)與植物組織器官及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期或生長(zhǎng)年限有關(guān)（Xu et al.，2007），CHS基因早期在葉中的表達(dá)量最高，主要是參與生長(zhǎng)激素運(yùn)輸和器官形態(tài)建成，與Knogge等（1986）的研究觀點(diǎn)一致。隨著植株的成熟，3年生莖中的表達(dá)量最高，此時(shí)CHS基因主要參與次生代謝物黃酮類化合物的合成。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究鐵皮石斛中CHS基因的功能及表達(dá)調(diào)控打下了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

鐵皮石斛CHS基因保守性較高，在幼苗生長(zhǎng)階段整體表達(dá)量較高，說(shuō)明CHS基因早期主要參與植物激素運(yùn)輸和器官形態(tài)建成；隨著植株的成熟，3年生鐵皮石斛根及葉中的CHS基因表達(dá)量降低，莖中的表達(dá)量升高，說(shuō)明CHS基因后期主要參與黃酮類物質(zhì)合成。

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（責(zé)任編輯 王 暉）