岑貞陸 胡鈞銘 韋仕巖 何鐵光 李婷婷 曾泉

摘要：【目的】篩選蠶沙纖維素降解菌株，為蠶沙無(wú)害化快速腐熟處理提供優(yōu)質(zhì)菌種。【方法】以蠶沙為材料，利用 CMC-Na培養(yǎng)基分離蠶沙纖維素降解菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生化特征和16S rDNA序列測(cè)定方法等對(duì)分離獲得的纖維素降解菌進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并研究碳源、氮源、pH、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)分離菌株產(chǎn)酶活力的影響?！窘Y(jié)果】從蠶沙中篩選出1株高溫型細(xì)菌，命名為HB-2菌株。根據(jù)菌體大小、鞭毛著生位置及數(shù)量、16S rDNA核酸序列分析，并結(jié)合生理生化特性，HB-2菌株鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。HB-2菌株最佳產(chǎn)酶條件為復(fù)合碳源（蠶沙+微晶纖維素+米糠+麩皮）、復(fù)合氮源（蛋白胨+酵母膏），產(chǎn)纖維素酶最適反應(yīng) pH 6.5，最適溫度35 ℃。【結(jié)論】HB-2菌株CMCase活性較敏感且產(chǎn)酶量大，具有制成菌劑應(yīng)用于蠶沙無(wú)害化快速腐熟的潛力。

關(guān)鍵詞： 蠶沙；纖維素降解菌；短小芽孢桿菌；鑒定；酶活性

中圖分類號(hào)： Q939.124 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）12-2065-07

Abstract：【Objective】Cellulose-degrading bacteria were isolated from silkworm， in order to provide high-quality strain for harmless quick composting of silkworm excrement. 【Method】Using CMC-Na culture medium， cellulose-degrading bacteria were isolated from silkworm excrement. Then obtained cellulose-degrading bacteria were identified based on its morphology， biochemical characters， 16S rDNA sequence etc. And effects of carbon source， nitrogen source， pH， culture time and culture temperature on cellulase activity of isolated strain were studied. 【Result】Results showed that， a strain of high-temperature resistant bacterium was screened out， which was named HB-2 strain. According to its size， flagella position and number， 16S rDNA sequence and physio-biochemical characteristics， HB-2 strain was identified as Bacillus pumilus. Enzyme-producing conditions of HB-2 strain were as follows： composite carbon sources including silkworm excrement+microcrystalline cellulose+rice bran+wheat bran， composite nitrogen sources including peptone+yeast extract， optimum pH for cellulose producing being 6.5， optimum temperature for cellulose producing being 35 ℃. 【Conclusion】HB-2 strain has sensitive CMCase activity and produces a large amount of cellulase， so which can be made into bactericide， then applied to harmless quick composting of silkworm excrement.

Key words： silkworm excrement； cellulose-degrading bacteria； Bacillus pumilus； identification； enzyme activity

0 引言

【研究意義】蠶沙是蠶排出的糞便、食剩殘桑及蠶座墊料的統(tǒng)稱（楊海霞等，2002）。近年來(lái)，隨著我國(guó)“東桑西移”工程的推進(jìn)發(fā)展，養(yǎng)蠶集約化程度逐步提高，蠶沙產(chǎn)生量也逐年增加。目前蠶沙的利用率較低，除極少部分被用來(lái)提取葉綠素、蛋白質(zhì)和果膠等外，部分蠶沙堆漚用作肥料（高云超等，2011），但蠶沙富含蛋白質(zhì)和大量難降解的纖維素，由于纖維素降解速度較慢，致使蠶沙堆肥發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、肥效低，同時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的臭味難以消除而造成空氣污染，雨水沖刷又極易造成面源污染（劉鵬等，2014）；此外，未經(jīng)處理直接丟棄的蠶沙帶有的蠶病原菌傳播和環(huán)境污染問(wèn)題等嚴(yán)重影響桑蠶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，篩選和分離高產(chǎn)纖維素酶的功能降解菌種，研究其對(duì)蠶沙纖維素的降解能力，對(duì)蠶沙的生物無(wú)害化處理，實(shí)現(xiàn)蠶沙資源化循環(huán)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，木質(zhì)纖維素降解酶的研究與應(yīng)用主要集中于產(chǎn)酶量大、酶系組成較齊全的菌株（孫憲昀等，2007）。張明珠等（2008）從江蘇省泰州市的農(nóng)田土壤和木材廠腐爛的木材中篩選出白腐真菌、綠色木霉、纖維單胞菌、肋生菌、單胞菌、黑曲菌和節(jié)桿菌等7種具有降解纖維材料能力的菌株。王洪媛和范丙全（2010）采用濾紙片孔洞法、濾紙條降解法、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解圈測(cè)定法、秸稈失重法、纖維素分解率測(cè)定法、胞外酶活測(cè)定法等常規(guī)秸稈纖維素降解菌的篩選方法，篩選獲得3株高效秸稈纖維素降解真菌菌株。已有學(xué)者利用纖維素降解菌對(duì)動(dòng)物草料青貯、動(dòng)物飼料、甘蔗渣等的纖維素降解效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。王賢豐等（2015）從海水中篩選得到2株對(duì)甘蔗渣纖維素酶活力較高的纖維素降解菌Z4和S5，兩者適宜比例的混合發(fā)酵可明顯提高對(duì)甘蔗渣纖維素的降解能力。黃勤樓等（2016）從引進(jìn)的多種纖維素降解菌中篩選出酶活力較高的11、21和36號(hào)菌株，3株菌株均能改善牧草的青貯品質(zhì)，且不同程度地降解牧草纖維素。王堯悅等（2016）對(duì)課題組前期分離保存的一株纖維素降解菌進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)其對(duì)飼料粗纖維的降解效果，結(jié)果表明，分離到的纖維降解菌為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis N3，N3菌株主要分泌分子質(zhì)量70 ku以上、耐熱的纖維素酶，對(duì)飼料粗纖維有較強(qiáng)的降解能力。【本研究切入點(diǎn)】目前鮮見蠶沙堆肥中纖維素降解菌的文獻(xiàn)報(bào)道，僅岑貞陸等（2013a）通過(guò)不同的培養(yǎng)基查明廣西蠶沙纖維素降解菌群中細(xì)菌、放線菌、真菌的分離頻率，以及對(duì)放射線菌T-1菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，但尚未對(duì)分離所得菌株進(jìn)行鑒定，菌株分類學(xué)地位不明確，致使其利用缺乏依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用濃度梯度稀釋法從蠶沙堆肥中分離纖維素降解菌，對(duì)分離獲得的纖維素降解菌開展分類學(xué)鑒定，并測(cè)定菌株纖維素酶活性，以期為蠶沙無(wú)害化快速腐熟處理提供優(yōu)質(zhì)菌種。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料蠶沙采自廣西南寧市橫縣云表鎮(zhèn)。

供試培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基（方中達(dá)，1998）：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖5.0 g，瓊脂 17.0 g，蒸餾水1 L， pH 7.0；CMC-Na培養(yǎng)基（王海濱等，2015）：CMC-Na 10.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂17.0 g/L，pH 7.0。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 纖維素降解菌的分離及酶活性測(cè)定 纖維素降解菌分離參照張楠等（2010）的方法進(jìn)行。若觀察到菌落生長(zhǎng)處及周圍形成一透明圈，則表明獲得目標(biāo)纖維素降解菌，將目標(biāo)纖維素降解菌菌株純化后備用。

對(duì)分離所得菌株進(jìn)行纖維素酶活性測(cè)定，其中羧甲基纖維素酶（CMCase）和濾紙酶（FPAase）活性測(cè)定參照張楠等（2010）的方法執(zhí)行。

1. 2. 2 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察 分離所得菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～36 h后參照文獻(xiàn)（方中達(dá)，1998）進(jìn)行革蘭氏染色觀察，并觀察菌落及菌體形態(tài)。

1. 2. 3 分離菌株生理生化測(cè)定 分離所得菌株采用微量反應(yīng)管（購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司）進(jìn)行生理生化測(cè)定，測(cè)試項(xiàng)目有葡萄糖氧化發(fā)酵測(cè)定、硝酸鹽還原反應(yīng)、反硝化、甲基紅（M.R.）、H2S、牛奶分解、明膠液化、接觸酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、Tween-80、檸檬酸鹽的利用、吲哚試驗(yàn)等12項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（Buchanan and Gibbons，1984）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）進(jìn)行分析。

1. 2. 4 16S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

1. 2. 4. 1 DNA提取 采用煮沸法（岑貞陸等，2013b）提取測(cè)試菌株的基因組DNA：挑取一環(huán)新鮮菌苔（NA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24 h）于0.5 mL無(wú)菌水中振蕩混勻；于100 ℃沸水中煮5 min，迅速置于冰水混合物中冰浴10 min后120 r/min 離心8 min，取上清液作為模板DNA，-20 ℃保存，用于PCR擴(kuò)增。

1. 2. 4. 2 菌株DNA的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增采用16S rDNA細(xì)菌通用引物，正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'，反向引物：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。PCR反應(yīng)體系25.0 μL，包括10× Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.0 μL， E×Taq enzyme（5 U/μL）0.2 μL，正向引物（10 pmoL）1.0 μL，反向引物（10 pmoL）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 18.3 μL，以ddH2O為模板作陰性對(duì)照。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)儀進(jìn)行觀察及拍照，并送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 2. 4. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建 核苷酸序列利用Clustal X 1.81進(jìn)行聯(lián)配，聯(lián)配結(jié)果用BIOEDIT編輯，利用MEGA 4.0構(gòu)建由核苷酸序列生成的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，參數(shù)利用Neighbour-Joining，通過(guò)1000次Bootstrap抽樣及最大似然組成模型。

1. 2. 5 分離菌株產(chǎn)酶條件

1. 2. 5. 1 不同碳源對(duì)分離菌株產(chǎn)酶的影響 去除碳源后的發(fā)酵培養(yǎng)基分別加入5%碳源（蠶沙、米糠、微晶纖維素、蠶沙+米糠、麩皮、微晶纖維素+米糠、蠶沙+麩皮、米糠+麩皮、微晶纖維素+麩皮、蠶沙+微晶纖維素+米糠+麩皮），接種分離菌株培養(yǎng)，分別測(cè)定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 2 不同氮源對(duì)分離菌株產(chǎn)酶的影響 去除氮源后的發(fā)酵培養(yǎng)基分別加入4%氮源[KNO3、（NH4）2SO4、NH4CL、尿素、蛋白胨、酵母膏、尿素+酵母膏、尿素+蛋白胨、酵母膏+蛋白胨]，接種分離菌株后培養(yǎng)，分別測(cè)定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 3 不同pH對(duì)分離菌株產(chǎn)酶的影響 分別將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，接種分離菌株培養(yǎng)7 d后，分別測(cè)定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 4 不同溫度對(duì)分離菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基接種分離菌株后分別置于不同溫度（30、35、40、45、50和55 ℃）下培養(yǎng)，然后分別測(cè)定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)分離菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基接種分離菌株后連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天測(cè)定CMCase和FPAas活性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 目標(biāo)纖維素降解菌的分離及其酶活測(cè)定結(jié)果

從樣品中篩選出1株高溫型細(xì)菌，命名為HB-2菌株。HB-2菌株菌落直徑3.18 mm，水解圈半徑8.26 mm（圖1），水解圈半徑與菌落直徑的比值為2.60， CMCase和FPAase活性分別為3.32和0.70 U。

2. 2 HB-2菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

HB-2菌株單菌落呈不規(guī)則狀，表面褶皺凸起，邊緣多枝，菌落黃色，不透明，無(wú)粘性，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色陽(yáng)性，有芽孢（圖2）。在透射電鏡下觀察，菌體呈桿狀，兩端圓鈍，菌體大小約1.0 μm×2.4 μm，顏色較深，鞭毛周生（圖3）。

2. 3 HB-2菌株生理生化測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果（表1）顯示，HB-2菌株生理生化反應(yīng)為陽(yáng)性的項(xiàng)目有：氧化酶、接觸酶、檸檬酸鹽利用、H2S、明膠液化、牛奶分解和Tween-80；生理生化反應(yīng)為陰性的項(xiàng)目有：葡萄糖氧化發(fā)酵、M.R.、硝酸鹽還原、吲哚試驗(yàn)和反硝化。

2. 4 HB-2菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建及同源性分析

經(jīng)過(guò)引物對(duì)HB-2菌種進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1條約1500 bp條帶（圖4），經(jīng)測(cè)序后得到的16S rDNA序列提交至www.ncbi.nlm.nlh.gov，BLAST比對(duì)結(jié)果表明，HB-2菌株與IHBB9209、NE16、MB-P8等Bacillus pumilus菌株的序列相似性在99.%以上。采用MEGA 4.0分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HB-2菌株與登錄號(hào)為KR085783.1、KR868768.1、KP235238.1、HM022734.1等B. pumilus聚成一簇（圖5），與同屬的其他種存在明顯的遺傳距離。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及生理生化性狀，可將HB-2菌株鑒定為短小芽孢桿菌（B. pumilus）。

2. 5 HB-2菌株產(chǎn)酶條件

2. 5. 1 碳源對(duì)HB-2菌株產(chǎn)酶的影響 由表2可看出，碳源對(duì)HB-2菌株產(chǎn)酶能力有不同程度的影響。HB-2菌株對(duì)復(fù)合碳源的利用明顯強(qiáng)于單一碳源，可溶性碳源和不溶性碳源組成的復(fù)合碳源能更有效地誘導(dǎo)該菌產(chǎn)生纖維素酶，其中以蠶沙+微晶纖維素+米糠+麩皮為碳源時(shí)CMCase和FPAase的活性最高，分別為17.8和3.4 U。

2. 5. 2 氮源對(duì)HB-2菌株產(chǎn)酶的影響 表3結(jié)果顯示，KNO3、NH4CL、（NH4）2SO4和尿素等無(wú)機(jī)氮源對(duì)誘導(dǎo)HB-2菌株產(chǎn)CMCase和FPAase能力均較弱。蛋白胨、酵母膏、蛋白胨+酵母膏等有機(jī)氮源有利于誘導(dǎo)HB-2菌株產(chǎn)CMCase，其中以蛋白胨+酵母膏為復(fù)合有機(jī)氮源的處理區(qū)產(chǎn)CMCase最高（16.4 U）；HB-2菌株對(duì)供試氮源產(chǎn)FPAase不敏感，所有處理區(qū)的酶活性不超過(guò)3.7 U（表3）。

2. 5. 3 pH對(duì)HB-2菌株產(chǎn)酶的影響 由圖6可知，HB-2菌株在pH 4.0～10.0均可產(chǎn)酶，隨著pH升高，F(xiàn)PAase活性隨之增加，但增幅很窄，在供試pH內(nèi)FPAase活性不超過(guò)2.0 U；而CMCase活性對(duì)pH較敏感，當(dāng)pH為5.5時(shí)酶活開始陡升，當(dāng)pH為6.5時(shí)CMCase活性達(dá)到峰值（8.0 U），此后下降。

2. 5. 4 溫度對(duì)HB-2菌株產(chǎn)酶的影響 由圖7可知，HB-2菌株在30～55 ℃時(shí)均可產(chǎn)酶，但CMCase活性比FPAase活性變幅大，F(xiàn)PAase活性變幅較平緩，表明CMCase比FPAase對(duì)溫度更敏感。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)CMCase活性達(dá)峰值（7.0 U），此后酶活隨溫度升高而降低，酶活性曲線變陡降值明顯；當(dāng)溫度為50 ℃以后，CMCase活性趨于平穩(wěn)，不超過(guò)4.0 U。FPAase對(duì)溫度不敏感，酶活性變幅平緩，供試溫度內(nèi)不超過(guò)2.0 U。

2. 5. 5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)HB-2菌株產(chǎn)酶的影響 由圖8可知，接種HB-2菌株第2 d后 FPAase活性略有降低，第4 d后開始略微升高，但增值非常緩慢，直至第8 d才達(dá)到最高值（2.0 U）；接種后第1～6 d CMCase活性緩慢增加，第6 d后增值明顯，第8 d達(dá)最高值（7.0 U）。

3 討論

本研究根據(jù)菌體大小、鞭毛著生位置及數(shù)量、16S rDNA核酸序列分析，并結(jié)合生理生化指標(biāo)對(duì)HB-2菌株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)HB-2 菌株屬短小芽孢桿菌（B. pumilus）。B. pumilus是芽孢桿菌屬的一種，在自然界普遍存在，在水樣、土樣、禽畜糞便、動(dòng)物、植物（張立靜等，2011；霍培元等，2012；韋露等，2015）等各種環(huán)境中均可分離獲得。該菌有的可產(chǎn)生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗物質(zhì)，抑菌范圍廣，對(duì)動(dòng)植物多種病原菌具有抑制作用（王靜等，2010），有的可作為微生物飼料添加劑（徐鵬等，2012），有的能產(chǎn)生抗腫瘤多糖（梁靜娟等，2006），有的可降解苯并[a]芘（朱婷婷和倪晉仁，2012）。本研究明確了HB-2菌株能降解蠶沙纖維素，有利于豐富人們對(duì)B. pumilus生物學(xué)多樣性的認(rèn)識(shí)。

石美寧等（2012）利用酵素菌、劉鵬等（2014）通過(guò)草酸青霉菌、賓榮佩等（2015）采用多種復(fù)合菌劑應(yīng)用于蠶沙堆肥促進(jìn)腐熟研究，但上述研究者均以外源菌劑微生物途徑對(duì)蠶沙進(jìn)行堆肥促腐，而本研究探討內(nèi)源菌株（蠶沙土著微生物纖維素降解菌B. pumilus）的酶活性及其降解特性，這方面的研究國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。 無(wú)論是外源菌劑還是內(nèi)源菌株，目前蠶沙的微生物降解可供選擇的菌種譜仍明顯狹窄。蠶沙中微生物體系相當(dāng)復(fù)雜，目前尚未發(fā)現(xiàn)蠶沙菌群結(jié)構(gòu)及其時(shí)空分布的文獻(xiàn)，除從樣本分離獲得HB-2菌株外，還有其他細(xì)菌和放射線菌（岑貞陸等，2013a），由于可供參考的資料和基因庫(kù)信息極為有限，更多的蠶沙土著微生物的鑒定工作尚待開展，對(duì)于HB-2菌株在蠶沙堆肥降解纖維素的機(jī)制及其遺傳調(diào)控基礎(chǔ)等問(wèn)題也有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

功能性纖維素降解菌HB-2菌株有芽孢且適宜生長(zhǎng)的溫度及pH均較廣，具有較高的抗逆性和適應(yīng)力，方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸；HB-2菌株CMCase酶活較敏感且產(chǎn)酶量大，具有制成菌劑應(yīng)用于蠶沙無(wú)害化快速腐熟的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）