袁輝林　康麗華

摘 要 利用15N穩(wěn)定性同位素示蹤法，研究施氮水平對(duì)接種或不接種植物促生菌的桉樹(shù)幼苗生物量、N和P吸收量及其吸收氮素來(lái)源的影響。結(jié)果表明：隨著施氮量的增加，桉樹(shù)幼苗植株生物量、N和P吸收量均顯著增加。接種PGPR SZ7-1植物促生菌能顯著促進(jìn)桉樹(shù)幼苗生物量的增加和養(yǎng)分量的吸收。未接種植物促生菌的桉樹(shù)幼苗，其植株吸收氮素主要來(lái)源于土壤，其次是肥料；而接種PGPR SZ7-1植物促生菌的桉樹(shù)幼苗，其植株吸收的氮素則主要來(lái)源于生物固氮。PGPR SZ7-1植物促生菌具有較好的固氮能力，固氮率達(dá)40%以上。結(jié)果還顯示，隨著施氮量的增加，接種植物促生菌的桉樹(shù)幼苗生物固氮能力下降，植株氮素主要來(lái)源于土壤氮，其次為生物固氮和肥料氮。在較低的氮素水平下，接種植物促生菌能有效促進(jìn)桉樹(shù)植株的生長(zhǎng)發(fā)育和養(yǎng)分吸收，是一種減少肥料施用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境的農(nóng)業(yè)措施之一。

關(guān)鍵詞 桉樹(shù)；PGPR SZ7-1；氮素；15N示蹤

中圖分類(lèi)號(hào) Q949.762.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

植物促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria簡(jiǎn)稱(chēng) PGPR）是指定殖于植物根際系統(tǒng)，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一類(lèi)細(xì)菌的總稱(chēng)[1]。PGPR對(duì)宿主植物生長(zhǎng)的影響及其固氮量一直受到廣大研究者關(guān)注[2-4]。一般認(rèn)為PGPR具有固氮、解磷、釋鉀、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一的能力，且對(duì)土壤中有害病原微生物與非寄生性根際有害微生物具有一定的生防作用[5-7]，對(duì)植物吸收利用礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)有促進(jìn)作用，并可以產(chǎn)生有益于植物生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[8-9]。世界發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)PGPR的研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用已有多年歷史，國(guó)內(nèi)對(duì)PGPR的研究及生物菌肥的生產(chǎn)近年來(lái)也在不斷增加，且越來(lái)越多的研究指出，PGPR 接種劑經(jīng)過(guò)商品化生產(chǎn)，可作為殺蟲(chóng)劑和無(wú)機(jī)肥料的替代品而廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中[10-11]。然而，當(dāng)前PGPR的研究大部分局限于菌種的篩選和作用效果的比較上，而對(duì)其深層的促生機(jī)理研究不多，尤其是植物在接種PGPR后，氮在土壤-微生物-植物系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化規(guī)律研究較少。

肥料氮、土壤氮以及生物作用固定的氮在土壤-微生物-植物系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化受眾多因素的影響，其過(guò)程比較復(fù)雜，利用15N同位素示蹤法測(cè)定生物固氮率可以避免間接效應(yīng)對(duì)固氮量測(cè)定的影響，被認(rèn)為是確定固氮作用定性和定量最直接、最可靠、最標(biāo)準(zhǔn)的方法[12]。該法依據(jù)固氮系統(tǒng)在N基質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的生長(zhǎng)后，如在該系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)N被稀釋?zhuān)瑒t證明發(fā)生了固氮作用[13-14]。本研究應(yīng)用15N示蹤技術(shù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)分離保存的一株 PGPR SZ7-1[15]的固氮效果進(jìn)行研究，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)探討了不同施氮水平下該促生菌的固氮效果和氮素在土壤-微生物-桉樹(shù)系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化規(guī)律，以便為 PGPR肥的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物和土樣 植物品種為尾葉桉（Eucalyptus urophylla），來(lái)自雷州半島。土壤養(yǎng)分為：有機(jī)質(zhì)3.116 g/kg、全氮0.222 g/kg、全磷0.147 g/kg、全鉀8.058 g/kg、速效氮18.50 g/kg 、速效磷0.26 g/kg、速效鉀17.66 g/kg、交換酸4.816 cmol（H++1/3Al3+）/kg，土壤pH值為4.43。

1.1.2 供試菌株 促生菌PGPR SZ7-1菌株，由本實(shí)驗(yàn)室從紅樹(shù)林植物根系中分離篩選并保存[15]。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用盆栽方法，共設(shè)2組處理，分別為接菌和不接菌，接菌組接菌量為10 mL/植株（109 CFU）；不接菌為對(duì)照組（CK），加入10 mL已滅菌的水；3個(gè)氮素處理水平分別為N0（0 mg/kg）、N1（30 mg/kg）、N2（60 mg/kg），每個(gè)處理重復(fù)9盆。試驗(yàn)氮肥為15N豐度11.22%的硫酸銨，施用方法：將同位素溶于水，種植前均勻施入土壤。實(shí)驗(yàn)用盆缽為H×D=10.5 cm×11.5 cm的塑料盆，每盆裝入直徑為5 cm的已滅菌土（121 °C，60 min）1.4 kg，且每盆一次性施入Jensen無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液250 mL。首先將尾葉桉種子在95%酒精中浸泡10 min，再放入0.1%氯化汞溶液中消毒5 min后，用滅菌水沖洗多次；然后將種子播種于已滅菌的沙盤(pán)中，1個(gè)月后，待生長(zhǎng)至3～4 cm時(shí)移苗，每盆一株幼苗。將氮肥配成水溶液一次性施入。溫室條件為：濕度60%，夜晚溫度18 °C，白天溫度25 °C，每天澆水2次。

1.2.2 樣品處理 栽種16周后，植株樣品采集分地上和地下2部分進(jìn)行，每處理取5組重復(fù)，收割后量株高，并于烘箱中80 °C烘干48 h至恒重，再分別稱(chēng)取干重。樣品經(jīng)烘干、粉碎、過(guò)篩后用于全氮、全磷及15N的分析測(cè)定。

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法 全氮含量測(cè)定采用改良凱氏消化法，全磷含量測(cè)定采用鉬銻抗比色法[16]。將植株樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，測(cè)定15N豐度，具體計(jì)量方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。用15N同位素稀釋法計(jì)算尾葉桉幼苗氮素中來(lái)自生物固氮的百分?jǐn)?shù)（%Ndfa）、來(lái)自肥料的百分?jǐn)?shù)（%Ndff）、來(lái)自土壤氮的百分?jǐn)?shù)（%Ndfs）[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，統(tǒng)計(jì)分析采用Minitab15.0軟件處理。計(jì)算公式如下：

氮吸收量=植株干重（g/盆）×植株含氮量（%）

%Ndfa=（1-固氮植株15N原子百分超÷非固氮植株的15N原子百分超）×100%

%Ndff=植株15N原子百分超÷肥料15N原子百分超×100%

%Ndfs=1-%Ndfa-%Ndff

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮水平與促生菌對(duì)尾葉桉幼苗生物量的影響

盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，接種 PGPR SZ7-1的尾葉桉幼苗無(wú)論在株高，還是干重方面均明顯優(yōu)于不接菌。在同等施肥水平下，其中接菌比不接菌（CK）處理全植株（N0、N1和N2）株高分別提高了22.87%、31.59%、31.36%；地上部分干重分別增加了136.61%、75.23%、70.80%；地下部分干重分別增加了75.47%、38.71%、16.67%，且方差分析結(jié)果顯示均差異顯著。這說(shuō)明接種 PGPR SZ7-1能明顯促進(jìn)尾葉桉幼苗生長(zhǎng)，增加其生物量。

在不同施肥水平下，株高隨施氮量的增加而增高，但接菌較不接菌（CK）處理差異不顯著。地上部分干重也隨施氮量的增加而增加，其中不接菌（CK）處理地上部分干重而言，N1和N2水平分別比N0水平提高了43.23%和76.77%；接菌處理地上部分干重N1和N2水平比N0水平提高了8.36%和30.36%。地下部分干重而言，不接菌（CK）處理隨施氮量的增加而增加，其中N1和N2水平分別比N0水平分別提高了75.47%和92.45%，而接菌處理地下部分干重則隨施氮量的增加而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中N1和N2水平分別比N0水平提高了38.71%和27.96%。

總之，在同等施肥水平下，無(wú)論是地上部分干重還是地下部分干重，接菌處理比不接菌（CK）處理增加明顯；但接菌處理在3個(gè)氮水平上增加幅度較不接菌（CK）處理要小得多，這可能與接菌后該促生菌能提供營(yíng)養(yǎng)有很大關(guān)系。

2.2 施氮水平和促生菌對(duì)尾葉桉幼苗氮吸收的影響

分析結(jié)果（表2）表明，各接菌處理的尾葉桉幼苗對(duì)氮素的吸收量均比不接菌（CK）處理顯著增加，說(shuō)明接菌處理能明顯提高尾葉桉幼苗的供氮能力。

各不接菌（CK）和接菌處理之間，在不同的施氮水平上，尾葉桉幼苗對(duì)氮素的吸收量均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，且在N2水平上，地上和地下部分全氮量均最高。其中不接菌（CK）處理的N1和N2水平地上部分氮吸收量分別比N0水平提高了49.47%和73.68%，地下部分氮吸收量分別比N0水平提高了65.00%和105.00%；接菌處理N1、N2水平地上部分吸收量分別比N0水平提高了11.16%和37.21%，地下部分氮吸收量分別比N0水平提高了2.38%和4.76%。接菌處理較不接菌（CK）處理在3個(gè)氮水平上增加幅度要小得多，這間接表明PGPR SZ7-1能為植物提供氮素營(yíng)養(yǎng)，具有一定的固氮能力。

2.3 施氮水平和促生菌對(duì)尾葉桉幼苗磷吸收的影響

表3顯示，各接菌處理的尾葉桉幼苗對(duì)磷的吸收量均比不接菌（CK）處理顯著增加，說(shuō)明接菌后促生菌能明顯促進(jìn)尾葉桉幼苗對(duì)磷的吸收。且各不接菌（CK）處理和接菌處理之間，在不同的施氮水平上，尾葉桉幼苗對(duì)磷素的吸收量也均呈現(xiàn)隨施氮量增加而增加的趨勢(shì)，但接菌處理的增加幅度較小，這間接表明PGPR SZ7-1能提高植物對(duì)磷的吸收量，具有一定的解磷作用。

2.4 施氮水平對(duì)尾葉桉幼苗不同氮素來(lái)源的影響

從測(cè)定結(jié)果（表4）可知，在試驗(yàn)研究的施肥水平內(nèi)，無(wú)論是接菌還是不接菌處理，隨著施氮含量的增加，植株全氮含量均隨之增加，且接菌明顯比不接菌（CK）處理的植株全氮含量高，是后者的2～3倍，方差分析顯示差異極顯著。

15N示蹤試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同施氮水平不接菌（CK）處理的尾葉桉幼苗對(duì)土壤氮的吸收率最高，且施氮水平對(duì)尾葉桉幼苗的氮素來(lái)源有一定影響，但影響幅度較小，表現(xiàn)為隨施肥量的增加，來(lái)自肥料氮的吸收率也隨之增加，而來(lái)自土壤的則減少；不同施氮水平接菌處理的尾葉桉幼苗多了一個(gè)氮素來(lái)源，即來(lái)自生物固氮，且固氮效率達(dá)到40%以上?？梢?jiàn)，PGPR SZ7-1具備良好的固氮能力，有著廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，在接菌處理中尾葉桉幼苗的氮素來(lái)源發(fā)生了一定變化，表現(xiàn)為：隨著施氮量的增加，來(lái)自肥料氮和土壤氮的氮素增加；相反，來(lái)自生物固氮的氮素則相應(yīng)減少。

3 討論與結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，PGPR SZ7-1能明顯促進(jìn)植株對(duì)氮和磷的吸收，接菌處理的氮、磷含量素較對(duì)照處理均顯著增加。且接菌處理較不接菌（CK）處理在3個(gè)氮水平上對(duì)氮和磷的吸收量增加幅度明顯要小，這間接表明PGPR SZ7-1能為尾葉桉幼苗提供氮素和磷素營(yíng)養(yǎng)，兼具固氮和解磷2種能力，對(duì)植株有著良好的促生作用，這與此前的報(bào)道（PGPR SZ7-1能促進(jìn)植物生長(zhǎng)）一致[15]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，相比不接菌（CK）處理，接菌處理表現(xiàn)為生物量顯著增加，且接菌處理的生物量在3個(gè)氮水平上增加幅度較不接菌（CK）處理明顯要小，這可能與接菌后該促生菌能提供營(yíng)養(yǎng)有關(guān)系，說(shuō)明PGPR SZ7-1對(duì)尾葉桉幼苗具有很好的促生能力。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室還考察了PGPR SZ7-1菌株對(duì)木欖植株的促生效果，研究表明，接種該菌株能很好地促進(jìn)木欖幼苗的生長(zhǎng)[19]。這說(shuō)明PGPR SZ7-1對(duì)植株有著良好的促生作用，且不針對(duì)某一特定植物，具有廣泛的應(yīng)用前景。

研究結(jié)果顯示，在本研究的施氮水平內(nèi)，不接菌（CK）處理表現(xiàn)為隨著施氮量的增加，尾葉桉幼苗對(duì)肥料氮的吸收率增加，而對(duì)土壤氮的吸收率則降低。而接菌處理的尾葉桉幼苗多了一個(gè)氮素來(lái)源，即可以來(lái)自生物固氮，固氮效率達(dá)到40%以上，且隨著施氮量的增加尾葉桉幼苗對(duì)肥料氮和土壤氮的吸收率增加，而來(lái)自生物固氮的氮吸收率則降低?？梢?jiàn)，施氮水平能影響植株的氮素來(lái)源，對(duì)生物固氮和土壤氮的吸收有影響，這與李躍森等[20]指出的施氮水平能影響植株的氮素來(lái)源的結(jié)論類(lèi)似。用PGPR SZ7-1當(dāng)接種菌劑時(shí)可適當(dāng)減少有關(guān)肥料的用量，能有效地提高土壤速效氮素的積累，這證實(shí)了Gaskins 等[21]提出的固氮菌在長(zhǎng)期氮素平衡中能有效積累氮素的結(jié)論。肥料氮、土壤氮以及生物作用固定的氮在土壤-植株系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化受眾多因素的影響，其過(guò)程是相當(dāng)復(fù)雜的，還有待進(jìn)行深入的詳細(xì)的研究。

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