齊素敏 張宗營 張程程 莊乾營 張思聰 周仙紅 于毅 劉永杰

摘要：為了解山東省不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群抗藥性與乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和細(xì)胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）的活性關(guān)系，采用分光光度計(jì)法測(cè)定不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群AChE、GJSTs、CarE和ODM的活性。結(jié)果表明：泰安市、莘縣、壽光市、臨沭縣4個(gè)地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群的AChE、GSTs和ODM活性較相對(duì)敏感品系均有不同程度升高，相對(duì)比值分別為1.43-2.42、1.24-3.07和1.28-2.61，且與相對(duì)敏感品系相比差異顯著（P<0.05），CarE相對(duì)比值為1.02-1.20，多數(shù)種群與相對(duì)敏感品系無顯著性差異。說明AChE、CJSTs和ODM與韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)，其活性相對(duì)比值可作為韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：韭菜遲眼蕈蚊；抗藥性；酶活性

中圖分類號(hào)：S436.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）02-0094-05

韭菜遲眼蕈蚊（BradVsia odoriphaga Yang etZhang），屬雙翅目眼蕈蚊科遲眼蕈蚊屬，是我國北方重要的蔬菜害蟲。韭菜遲眼蕈蚊生活周期短、繁殖力強(qiáng)，寄主范圍廣，可為害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫蘆科、傘形花科等7科30多種蔬菜，在江西、北京等地還為害食用菌。該蟲以幼蟲群集寄主根部蛀食，常造成韭菜缺苗斷壟，使韭菜減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，近年來發(fā)生有加重趨勢(shì)。目前，化學(xué)防治仍是控制韭菜遲眼蕈蚊的主要措施，隨著化學(xué)殺蟲劑的長期和大量使用，韭菜遲眼蕈蚊對(duì)常用殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性?？剐栽鰪?qiáng)使農(nóng)藥使用效率降低，加大了防治難度。了解韭菜遲眼蕈蚊的抗藥性狀況，明確抗性種群的生化機(jī)制，可有針對(duì)性地采取防治措施，提高防治效果。乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和細(xì)胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）是韭菜遲眼蕈蚊體內(nèi)重要的靶標(biāo)酶和解毒酶，與昆蟲抗藥性的產(chǎn)生存在一定關(guān)系。目前，有關(guān)韭菜遲眼蕈蚊抗藥性與AChE、GSTs、CarE和ODM活性關(guān)系的研究未見報(bào)道。本研究通過對(duì)山東省不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊抗藥性與4種酶活性關(guān)系的研究，進(jìn)一步明確AChE、GSTs、CarE和ODM與抗藥性產(chǎn)生的相關(guān)性，探討其生化特征作為韭菜遲眼蕈蚊抗藥性監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可行性，為有效治理該蟲提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

相對(duì)敏感種群：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)多代的韭蛆，期間未接觸任何藥劑，作為本試驗(yàn)相對(duì)敏感種群；

泰安種群：采自山東省泰安市邱家店鎮(zhèn)舊縣村小拱棚三年生韭菜地；

莘縣種群：采自山東省聊城市莘縣張寨鄉(xiāng)郭坊村小拱棚四年生韭菜地；

壽光種群：采自山東省壽光市化龍鎮(zhèn)埠西村小拱棚四年生韭菜地；

臨沭種群：采自山東省臨沂市臨沭縣曹莊鎮(zhèn)新華村小拱棚兩年生韭菜地。

每個(gè)地區(qū)種群均于2015年5月采集，室內(nèi)飼養(yǎng)一代，選取F1代供試。相對(duì)敏感種群和田間種群均選取個(gè)體大小較一致的健康3齡幼蟲做為供試蟲源。

1.2 供試藥劑

考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、GSTs測(cè)試盒、AChE測(cè)試盒、CarE測(cè)試盒，均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄·12H₂O），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄·2H₂O），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。氫氧化鈉（NaOH），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。三氯甲烷（trichloromethane），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。對(duì)硝基苯酚（p-ni-trophenol），西亞試劑。還原型輔酶Ⅱ（NADPH），上海伯奧生物科技有限公司。對(duì)硝基苯甲醚（4-nitroanisole），分析純，Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶源制備 ①乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）酶源制備。挑取韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，準(zhǔn)確稱重，按重量體積1∶9的比例加入生理鹽水，在碎冰中用玻璃勻漿器勻漿，2500r/min、4℃離心10min，取上清液作為酶源。

②羧酸酯酶（CarE）酶源制備。挑取韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，準(zhǔn)確稱重，按重量體積1∶（5～10）的比例進(jìn)行冰浴勻漿，15000r/min，4℃離心30min，取上清液作為酶源。

③細(xì)胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）酶源制備。挑取韭菜遲眼蕈蚊3齡幼蟲，準(zhǔn)確稱重，按重量體積1∶9的比例加入0.05mol/L pH 7.8磷酸緩沖液，余同①。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白（0.563g/L）作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 乙酰膽堿酯酶（AChE）活性測(cè)定 采用AChE試劑盒進(jìn)行測(cè)定，方法步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，重復(fù)3次。組織中AChE活力定義：每毫克組織蛋白在37℃保溫6min，水解反應(yīng)體系中1μmol基質(zhì)為1個(gè)活力單位。計(jì)算公式：

AChE活力（U/mg prot）=（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（1μmol/mL）÷樣本蛋白質(zhì)含量（mg prot/mL）

1.3.4 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活力測(cè)定采用GSTs試劑盒進(jìn)行測(cè)定，方法步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，重復(fù)3次。組織中GSTs活力單位定義：每毫克組織蛋白在37℃反應(yīng)l min扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GST濃度降低1μmol/L為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式：

GSTs活力（U/mg prot）=（對(duì)照OD值-測(cè)定OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（20μmol/L）×稀釋倍數(shù)（6倍）÷反應(yīng)時(shí)間（10min）÷樣本取樣量（0.1mL）×勻漿液蛋白濃度（mg prot/mL）]

1.3.5 羧酸酯酶（CarE）活性測(cè)定 采用CarE試劑盒進(jìn)行測(cè)定，方法步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，重復(fù)3次。按樣本質(zhì)量計(jì)算，組織勻漿中CarE的活力定義：每克組織在37℃每分鐘催化吸光值增加1，定義為1U。計(jì)算公式：

CarE活力（U/g）=67×（△A測(cè)定管-△A空白管）÷樣本質(zhì)量（g）

1.3.6 細(xì)胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）比活力測(cè)定參考Hansen等的方法。稱取一定量對(duì)硝基苯酚，將對(duì)硝基苯酚溶解在NaOH溶液中，配成梯度濃度對(duì)硝基苯酚的NaOH溶液，在400nm下比色，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。X軸為對(duì)硝基苯酚的量，Y軸為OD值。反應(yīng)總體系2mL：O.1mol/LpH7.8的磷酸緩沖液1270μL，0.36 mmol/LNADPH 200μL，3mmol/L對(duì)硝基苯甲醚30μL，酶液500μL。反應(yīng)體系在25℃振蕩溫育反應(yīng)30min，加入0.5mL lmol/L HCl終止反應(yīng)，再加入2.5mL三氯甲烷萃取反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚，在3000r/min下離心15min。取下層即三氯甲烷層1.5mL加入1.5mL O.5mol/L NaOH反萃取。NaOH萃取液在400nm比色分析，重復(fù)3次，得到OD值，以0.5mol/L NaOH溶液為對(duì)照。然后根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和每毫升酶液中所含蛋白的量求出每分鐘每毫克蛋白產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚摩爾數(shù)來表示酶活性[μmol/（min·mg）]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.O數(shù)據(jù)處理軟件和Microsoft Excel 2010表格軟件分析、處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AChE活性

不同地區(qū)種群韭菜遲眼蕈蚊乙酰膽堿酯酶（AChE）活性比較結(jié)果（表1）顯示，4個(gè)不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群AChE活性較相對(duì)敏感品系均有不同程度提高，與相對(duì)敏感種群的活性比值由高到低分別是莘縣、泰安、壽光和臨沭種群，分別為2.42、2.27、2.11和1.43倍。4個(gè)韭菜遲眼蕈蚊田間種群AChE活性與相對(duì)敏感品系A(chǔ)ChE活性差異顯著。

2.2 GSTs活性

不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性比較結(jié)果（表1）顯示，4個(gè)韭菜遲眼蕈蚊種群GSTs活性較相對(duì)敏感品系均有不同程度提高，莘縣種群的GST活性最高，是相對(duì)敏感品系的3.07倍；泰安和壽光種群的GST活性次之，分別為相對(duì)敏感品系的2.39和1.82倍；而臨沭種群相對(duì)比值是相對(duì)敏感品系的1.24倍，活性最低。4個(gè)韭菜遲眼蕈蚊田間種群與相對(duì)敏感品系GSTs活性均有顯著性差異。

2.3 CarE活性

不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群羧酸酯酶（CarE）活性比較結(jié)果（表1）顯示，4個(gè)韭菜遲眼蕈蚊田間種群CarE活性較敏感品系略有升高，泰安種群的CarE活性最高，是相對(duì)敏感品系的1.20倍，其它3個(gè)韭菜遲眼蕈蚊品系酶活性與相對(duì)敏感品系酶活性比值在1.02和1.06之間。4個(gè)韭菜遲眼蕈蚊田間種群CarE活性變化幅度較小，僅泰安種群CarE活性與相對(duì)敏感品系有顯著性差異。

2.4 0DM活性

不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群細(xì)胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）活性比較結(jié)果（表1）顯示，4個(gè)韭菜遲眼蕈蚊種群ODM活性較相對(duì)敏感品系均有不同程度提高，莘縣種群的ODM活性最高，是相對(duì)敏感品系的2.61倍，壽光和泰安種群的ODM活性次之，分別為相對(duì)敏感品系的1.50和1.47倍，這3個(gè)韭菜遲眼蕈蚊田間種群與相對(duì)敏感品系ODM活性有顯著性差異；而臨沭種群ODM活性相對(duì)比值是相對(duì)敏感品系ODM活性的1.28倍，兩者無顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

筆者已研究了泰安市、莘縣、壽光市、臨沭縣韭菜遲眼蕈蚊種群對(duì)6種殺蟲劑的抗藥性水平（另文），結(jié)果顯示4個(gè)不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群對(duì)毒死蜱、辛硫磷、高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯等常用藥劑均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。對(duì)有機(jī)磷類藥劑毒死蜱和辛硫磷，泰安、莘縣和壽光種群均產(chǎn)生了中等水平的抗性，莘縣種群抗性分別為30.47和24.05倍，泰安種群的抗性為19.67和25.69倍，壽光種群的抗性為15.97和17.80倍；莘縣種群對(duì)菊酯類藥劑高效氯氰菊酯也產(chǎn)生了中等水平的抗性，抗性為11.45倍。4個(gè)不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群中，臨沭種群抗性最低，對(duì)毒死蜱和辛硫磷產(chǎn)生了低等抗藥性，對(duì)兩種菊酯類藥劑還處于敏感狀態(tài)。

乙酰膽堿酯酶（AChE）是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)，靶標(biāo)敏感性降低是昆蟲抗藥性產(chǎn)生涉及的主要機(jī)制之一。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和細(xì)胞色素P450氧脫甲基酶（ODM）是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，研究表明，害蟲抗藥性的增強(qiáng)與殺蟲劑代謝相關(guān)的解毒酶活性的增強(qiáng)有關(guān)，而不同的解毒酶對(duì)不同殺蟲劑的抗性發(fā)展作用不同。研究結(jié)果顯示，4個(gè)不同地區(qū)韭菜遲眼蕈蚊種群AChE活性較敏感品系均有顯著性差異，說明AChE作為靶標(biāo)酶參與了韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的形成。莘縣種群對(duì)毒死蜱的抗性水平最高，其AChE的活性比值也最高，說明韭菜遲眼蕈蚊對(duì)常用藥劑的抗性與AChE活性具有正相關(guān)性。由此推斷，抗性韭菜遲眼蕈蚊AChE過高的表達(dá)量可能導(dǎo)致了其AChE敏感性的降低。具有抗性的田間種群GSTs和ODM活性較敏感品系有明顯升高，說明解毒酶GSTs、ODM活性增高是導(dǎo)致抗性產(chǎn)生的原因之一，抗性監(jiān)測(cè)和酶活試驗(yàn)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，抗性水平最高的莘縣韭菜遲眼蕈蚊種群，其GSTs、ODM活性也較高，泰安、壽光種群抗性水平較低，其GSTs、ODM活性較前者略低，抗藥性和酶活性具有一定的正相關(guān)性，進(jìn)一步證明了GSTs及ODM作為韭菜遲眼蕈蚊體內(nèi)解毒酶，其活性高低與韭菜遲眼蕈蚊的抗藥性水平密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，CarE活性的改變，是多種昆蟲產(chǎn)生抗藥性的重要生化因素之一，但本研究發(fā)現(xiàn)，田間韭菜遲眼蕈蚊種群CarE活性與相對(duì)敏感品系相比略有升高，4個(gè)種群中有3個(gè)種群CarE活性同相對(duì)敏感品系差異不顯著，說明韭菜遲眼蕈蚊CarE活性的變化與抗藥性水平無明顯相關(guān)性。

韭菜遲眼蕈蚊田間種群與相對(duì)敏感種群AChE、GSTs和ODM活性上的差異表明AChE、GSTs和ODM與韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，AChE、GSTs和ODM活性相對(duì)比值可作為韭菜遲眼蕈蚊對(duì)常用藥劑抗性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。CarE與抗藥性的關(guān)系不密切，其活性相對(duì)比值僅能作為韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的參考指標(biāo)。然而，對(duì)抗性韭菜遲眼蕈蚊酶活性測(cè)定的工作尚不全面，磷酸酯酶、超氧化物歧化酶等與昆蟲抗藥性有關(guān)的酶活性測(cè)定都未進(jìn)行，這些酶活性與韭菜遲眼蕈蚊抗藥性的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究和探討。