何奇松　陳磊　顏健華　許瑞勝　易春華　韋達(dá)有　馮淑萍　黃勝斌　梁晟　熊毅

摘要：【目的】通過原核表達(dá)并純化獲得O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因及其多表位基因的重組蛋白，為建立O型FMDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒及制備動(dòng)物高免血清提供技術(shù)支持。【方法】以O(shè)型FMDV VP1全基因重組質(zhì)粒pMD18-T-T-VP1及串聯(lián)的VP1多表位基因重組質(zhì)粒pMD18-T-O-VP1為模板，通過特異性引物擴(kuò)增并回收目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL211（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，并以SDS-PAGE和Western blotting對(duì)融合蛋白進(jìn)行分析鑒定?！窘Y(jié)果】O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大腸桿菌BL21（DE3）中得到正確表達(dá)，表達(dá)的兩種融合蛋白主要以包涵體形式存在，純度較高，且均能與豬抗O型FMDV陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性?！窘Y(jié)論】表達(dá)獲得的融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為包被抗原應(yīng)用于O型FMDV抗體檢測(cè)試劑盒研發(fā)。

關(guān)鍵詞： O型FMDV；VP1基因；多表位基因；原核表達(dá)；純化；鑒定

中圖分類號(hào)： S852.659.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）03-0472-06

0 引言

【研究意義】口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）已被列為A類動(dòng)物傳染病，是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種高度接觸性傳染?。⊿obrino et al.，2001；顏健華等，2015）。FMDV可感染多種偶蹄動(dòng)物，傳播迅速，感染率高，一旦暴發(fā)將造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，許多國家高度重視對(duì)該病的研究。自2010年起，我國及周邊國家相繼發(fā)生O型FMD疫情（何繼軍等，2015），且與A型、Asia1型呈交替流行趨勢(shì)，涉及面廣、破壞性強(qiáng)（劉暢等，2013）。因此，加強(qiáng)FMD疫情監(jiān)測(cè)及預(yù)警預(yù)報(bào)，對(duì)有效防控FMD及促進(jìn)我國畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】組成FMDV衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白有4種，分別為VP1、VP2、VP3和VP4（Collen et al.，1991）。FMDV的抗原區(qū)域主要位于結(jié)構(gòu)蛋白VP1的第141～160位和第200～213位氨基酸殘基，可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，同時(shí)也是抗原性的高變區(qū)（Mateu et al.，1996；柳紀(jì)省，1999）。因此，研究分析FMDV主要抗原區(qū)域的高變區(qū)不僅對(duì)揭示病毒遺傳變異機(jī)理具有重要意義，還能為FMD流行病學(xué)研究及新型疫苗研制提供參考依據(jù)。目前，我國已有研究以VP1蛋白的第21～40位及第141～160位基因片段與β-半乳糖甘基因構(gòu)建重組表達(dá)載體（楊志軍等，2000），或?qū)⒇i重鏈恒定區(qū)作為抗原載體的DNA疫苗（李金光等，2001），經(jīng)相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)免疫效果良好。梁特等（2013）、解銀麗等（2015）采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建并表達(dá)了O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒，為O型FMDV疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。特尼格爾等（2015）研制的多型FMDV VP1表位融合蛋白與O型、A型和Asia1型FMDV陽性血清均能特異性結(jié)合，為VP1表位肽的免疫原性研究提供了參考?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于O型FMDV近年來的流行趨勢(shì)及FMDV抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，且不同血清型、基因型和分離株間的抗原位點(diǎn)及抗原表位均存在差別，因此有必要針對(duì)O型FMDV的VP1基因及其主要的抗原表位進(jìn)行深入研究，為今后有效防控O型FMD提供參考?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)O型FMDV VP1基因及串聯(lián)的VP1多表位基因進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)所得的兩種目的蛋白進(jìn)行鑒定，分析其特異性及反應(yīng)原性，以期為建立針對(duì)O型FMDV的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法及制備動(dòng)物高免血清提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

O型FMDV VP1全基因重組質(zhì)粒pMD18-T-T-VP1及串聯(lián)的VP1多表位基因重組質(zhì)粒pMD18-T-O-VP1由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心家畜疫病診斷實(shí)驗(yàn)室保存提供；DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素（Amp）貯存液、大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、小量質(zhì)粒提取試劑盒等購自天跟生化科技（北京）有限公司；EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、IPTG等購自寶生物工程（大連）有限公司；豬抗O型FMDV陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗豚鼠IgG抗體、低分子量蛋白質(zhì)Marker購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)原核表達(dá)載體（pET-32a和pGEX-6p-1）的酶切位點(diǎn)、FMDV VP1基因開放閱讀框及其串聯(lián)后VP1多表位基因，運(yùn)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)表達(dá)引物（表1）。每條上游引物的5'端均添加EcoR I酶切位點(diǎn)（下劃線部分），下游引物的5'端均添加Xho I酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 原核重組表達(dá)載體構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pMD18-T-T-VP1和pMD18-T-O-VP1為模板，用特異性引物VP1/VP2、O1/O2擴(kuò)增并回收目的基因。采用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，并用同樣的酶切處理原核表達(dá)載體pET-32a和pGEX-6p-1，分別將擴(kuò)增獲得的目的基因酶切回收產(chǎn)物與表達(dá)載體的酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒后，對(duì)陽性重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1進(jìn)行鑒定。

1. 4 誘導(dǎo)表達(dá)重組菌

對(duì)陽性重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的菌液進(jìn)行復(fù)蘇，于37 ℃下?lián)u床（180 r/min）過夜培養(yǎng)。將復(fù)蘇菌液加入到含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃下斜搖（200 r/min）培養(yǎng)，待菌液OD值達(dá)0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在重組菌誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1、2、3、4和5 h取樣，離心收集菌體后，通過SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況，再采用掃描的方法分析重組蛋白在菌體中的具體含量。

1. 5 重組表達(dá)菌表達(dá)形式確定

在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下，取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液50 mL，10000×g離心10 min，棄上清液；用PBS洗滌重組菌沉淀，重復(fù)洗滌3次；加入30 mL PBS重懸重組菌沉淀，反復(fù)凍融3次后，在冰浴中超聲波裂解40 min；離心后分別收集裂解的沉淀和上清液，通過SDS-PAGE分析表達(dá)目的蛋白的表達(dá)形式。

1. 6 重組蛋白純化

重組蛋白pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1均采用柱層析純化方法進(jìn)行純化，其純化步驟按照試劑盒說明進(jìn)行操作，然后采用SDS-PAGE分析兩個(gè)重組蛋白的純化效果。

1. 7 Western blotting鑒定

將已純化好的重組蛋白PET-32a-VP1和pGEX- 6P-1-VP1進(jìn)行SDS-PAGE分析，目的蛋白通過蛋白轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上，然后參照汪家政和范明（2000）的方法進(jìn)行Western blotting鑒定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 原核重組表達(dá)載體

采用特異性表達(dá)引物VP1/VP2擴(kuò)增得到完整的VP1基因，大小為639 bp（圖1）；采用特異性表達(dá)引物O1/O2擴(kuò)增得到含VP1主要抗原位點(diǎn)基因片段，大小為384 bp（圖2），兩個(gè)目的片段均與預(yù)期結(jié)果一致。將兩個(gè)目的片段分別克隆至原核表達(dá)載體pET-32a和pGEX-6p-1，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的目的片段與預(yù)期結(jié)果一致（圖3和圖4）。

2. 2 重組菌的融合表達(dá)及SDS-PAGE分析結(jié)果

重組菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1、2、3、4和5 h取樣， SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組菌pET-32a-VP1/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5 h后其目的蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值，在相對(duì)分子量44.0 kD處有一條明顯增量的蛋白條帶（圖5），與預(yù)期結(jié)果相符；重組菌pGEX-6P-1-VP1/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后其目的蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值，在相對(duì)分子量42.0 kD處出現(xiàn)一條明顯增量的蛋白條帶（圖6），與預(yù)期結(jié)果相符；而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液無任何表達(dá)蛋白條帶出現(xiàn)。

2. 3 融合表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果

以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h的重組菌pET-32a- VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21經(jīng)超聲波裂解后，收集超聲波裂解菌液離心所得上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，兩種融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式存在（圖7）。

2. 4 融合蛋白的純化結(jié)果

蛋白包涵體經(jīng)層析柱純化復(fù)性后，得到的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，且條帶較清晰、單一（圖8），說明融合蛋白純化效果較好。

2. 5 融合蛋白的Western blotting鑒定結(jié)果

對(duì)純化復(fù)性的融合蛋白pET-32a-VP1和pGEX- 6p-1-VP1進(jìn)行Western blotting鑒定，結(jié)果顯示在預(yù)期目的處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶（圖9和圖10），說明誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白均能與豬抗O型FMDV陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，即具有免疫學(xué)活性。

3 討論

FMDV的VP1基因由639個(gè)核苷酸組成，共編碼213個(gè)氨基酸，是病毒結(jié)構(gòu)中最重要的抗原位點(diǎn)及抗原變異的關(guān)鍵域區(qū)（Mateu et al.，1996；柳紀(jì)省，1999），可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。VP1蛋白的第21～40位氨基酸肽段是重要的T細(xì)胞抗原蛋白（Collen et al.， 1991）；第141～160位、第200～213位氨基酸肽段能夠保護(hù)動(dòng)物抵抗病毒攻擊，是重要的B細(xì)胞抗原表位（Bittle et al.，1983）；第40～60位氨基酸肽段具有調(diào)節(jié)第141～160位、第200～213位氨基酸抗原表位的功能，也是重要的B細(xì)胞抗原表位（Parry et al.，1990）。本研究選用的VP1多表位基因是由第21～60位、第141～160位及第200～213位氨基酸肽段串聯(lián)構(gòu)成，既含T細(xì)胞表位，又含B細(xì)胞表位。邵軍軍和?；菔|（2008）研究發(fā)現(xiàn)，可通過增加抗原表位、引入外源載體蛋白或T細(xì)胞表位等方法提高表位肽的免疫原性；在特異性免疫應(yīng)答中，T細(xì)胞表位發(fā)揮重要作用，且部分B細(xì)胞表位也需要與T細(xì)胞表位相互作用才能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抗體。因此，本研究選擇VP1全長(zhǎng)基因及VP1多表位基因作為表達(dá)的目的基因，以期鑒定兩種目的基因表達(dá)所得融合蛋白的反應(yīng)原性及特異性，并比較兩者間的差異，為下一步建立ELISA選擇合適的包被抗原及研制FMDV重組蛋白亞單位疫苗提供參考。

本研究誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體是由于融合蛋白在其自身的表達(dá)過程中對(duì)環(huán)境不適應(yīng)，導(dǎo)致不能形成正確的次級(jí)鍵或缺乏依稀蛋白質(zhì)折疊的輔助因子等原因所形成（夏啟玉等，2007）。以包涵體形式存在的重組蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)（羅莉等，2012）：（1）雜蛋白在包涵體中的含量較低，采用離心方法即可達(dá)到與可溶性蛋白分離的目的，便于分離純化；（2）可避免菌體蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解；（3）降低了胞內(nèi)外源蛋白濃度，利于目的蛋白表達(dá)量的提高；（4）包涵體對(duì)機(jī)械攪拌和超聲波破碎均不敏感，易與細(xì)胞膜碎片進(jìn)行分離。但以包涵體形式存在的重組蛋白是需要經(jīng)過變性劑溶解，再進(jìn)行復(fù)性才能得到溶解的蛋白質(zhì)。

本研究選取pET-32a和pGEX-6P-1為原核表達(dá)載體，其目的是為了避免載體自身表達(dá)蛋白與抗原蛋白產(chǎn)生非特異性結(jié)合，而產(chǎn)生假陽性對(duì)研究結(jié)果造成影響。大腸桿菌BL21（DE3）菌株是以T7 RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因蛋白表達(dá)宿主，尤其適合于非毒性蛋白的表達(dá)。本研究選取大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌表達(dá)FMDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1及其主要抗原位點(diǎn)的基因蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析和Werstern blotting鑒定，結(jié)果顯示，融合蛋白均得到正確表達(dá)。此外，選用大腸桿菌表達(dá)VP1多表位基因的蛋白作為包被抗原，可去除無關(guān)基因的干擾，提高包被抗原性，防止假陽性產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本研究表達(dá)獲得的融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為包被抗原應(yīng)用于O型FMDV抗體檢測(cè)試劑盒研發(fā)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）