郭曉強

G蛋白是許多生命科學(xué)研究者所熟知的一種分子。有關(guān)G蛋白的發(fā)現(xiàn)深化了對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的理解，也拓寬了生命科學(xué)包括生物醫(yī)學(xué)的眾多研究領(lǐng)域。因此，吉爾曼對G蛋白的純化具有里程碑的意義。

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的大量研究領(lǐng)域里，一類叫作G蛋白的生物分子被研究者們所熟知。這類分子對介導(dǎo)信號從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)的過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，因而與之相關(guān)的研究無論從論文數(shù)量還是從學(xué)術(shù)價值來講，都占據(jù)領(lǐng)域中顯著地位。

G蛋白全稱為“GTP結(jié)合蛋白質(zhì)”，是一類主要存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的蛋白質(zhì)分子，能與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合，具鳥苷三磷酸（GTP）水解酶活性。GTP與更多人熟知的ATP（腺苷三磷酸）均屬于核苷三磷酸（NTP）。ATP不僅在生物體內(nèi)起“能量貨幣”作用，還生成第二信使環(huán)腺苷酸（cAMP）；GTP同樣可環(huán)化生成環(huán)鳥苷酸（cGMP），而GTP的另一重要功能即與G蛋白有關(guān)。

在1994和2012年，諾貝爾獎兩度頒給從事G蛋白研究的科學(xué)家，其中1994年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎頒給美國生物化學(xué)家吉爾曼（Alfred Goodman Gilman），他通過G蛋白的純化，使人們深化了對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的理解與認(rèn)識。本文就來介紹這位先驅(qū)。

傳承生命科學(xué)“基因”

1941年7月1日，吉爾曼出生于美國康涅狄格州的紐黑文，父親是著名藥理學(xué)家艾爾弗雷德·扎克·吉爾曼（Alfred Zack Gilman）。1941年，扎克和同事古德曼（L.S.Goodman）出版了著名的《治療藥理學(xué)基礎(chǔ)》（The Pharmacological Basis of Therapeutics）一書，而吉爾曼恰好當(dāng)年出生，因此中間取名“Goodman”以示紀(jì)念古德曼。

扎克和古德曼是腫瘤化療領(lǐng)域先驅(qū)，1940年代首次開展氮芥治療淋巴瘤的研究，從而開創(chuàng)了一個全新領(lǐng)域，扎克也于1964年當(dāng)選美國科學(xué)院院士，這對吉爾曼的職業(yè)選擇和科學(xué)研究有重要幫助。孩提時，吉爾曼聆聽了父親的課程，訪問了實驗室并觀摩了藥理學(xué)實驗，這些經(jīng)歷促使吉爾曼將來從事生命科學(xué)研究。吉爾曼的大部分童年在紐約郊區(qū)的白原（White Plains）度過，十幾歲在參觀海登天文館（Hayden Planetarium）時深深被星際奧秘所吸引，一度想成為一名宇航員登上月球，但最終還是被父輩傳下的生命科學(xué)“基因”所征服。

1955年，吉爾曼進入康涅狄格州一所專為男孩設(shè)立的預(yù)備學(xué)校。吉爾曼因遠(yuǎn)離家庭而不開心，對學(xué)校過于刻板的建筑風(fēng)格也感到不滿，不過依然完成學(xué)業(yè)并進入耶魯大學(xué)深造，專業(yè)是生物化學(xué)。在耶魯大學(xué)，吉爾曼開始了自己的科研生涯，除完成基本實驗室操作外，還曾設(shè)計自己第一個獨立的科研計劃以檢驗克里克（F.H.C.Crick）“適配子假說”的正確性。計劃包含了極大的科研雄心（因為直接面向科學(xué)領(lǐng)域的最前沿），得到實驗室老師的鼓勵。盡管最終未獲成功，對培養(yǎng)吉爾曼的獨立思考能力卻有很大幫助。

加盟“強隊”

1962年，吉爾曼以優(yōu)異成績從耶魯大學(xué)畢業(yè)，獲得學(xué)士學(xué)位。當(dāng)年夏天，吉爾曼進入紐約寶威公司（Burroughs Wellcome）的康尼（A.Conney）實驗室開展酶的調(diào)控研究。不得不說，家庭的熏陶與個人的愛好使吉爾曼在科研方面具有先天優(yōu)勢，在公司短短幾個月就取得重要成果，完成兩篇重要論文并發(fā)表，此番經(jīng)歷也堅定了吉爾曼從事科學(xué)研究的信念。

1961年春，吉爾曼收到父親扎克的好友、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之父——薩瑟蘭（E.W.Sutherland Jr..1971年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）的邀請，后者建議他畢業(yè)后參加凱斯西儲大學(xué)（Case Western Reserve University）的醫(yī)學(xué)博士-理學(xué)博士計劃。吉爾曼最初對此并無太大興趣，但薩瑟蘭的多次邀請使他逐步改變了看法，于1962年秋來到克利夫蘭。遺憾的是薩瑟蘭不久離開凱斯西儲大學(xué)而加入范德比爾特大學(xué)，于是吉爾曼不得不跟隨薩瑟蘭原來的助手拉爾（T.Rall）進行實驗。

早在1957年，拉爾和薩瑟蘭研究發(fā)現(xiàn)，許多激素如胰高血糖素等并不直接進入細(xì)胞，而是借助細(xì)胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶，通過催化細(xì)胞內(nèi)ATP生成cAMP，由cAMP進一步激活生理反應(yīng)。據(jù)此，薩瑟蘭提出“第二信使假說”，將細(xì)胞外激素稱為“第一信使”，而將隨后生成的cAMP稱為“第二信使”。此假說奠定了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本模式。

在拉爾實驗室，吉爾曼主要開展甲狀腺中cAMP的研究，同時開啟了自己在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域（重點在cAMP相關(guān)分子）四十余年的職業(yè)歷程。研究中吉爾曼一方面意識到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要性，并掌握了相關(guān)的研究思路和方法，另一方面熟悉了常用生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等的實驗操作，為以后更加獨立地開展工作奠定了基礎(chǔ)。

1969年吉爾曼獲得博士學(xué)位，同時獲得3年博士后獎學(xué)金，從而有機會來到位于貝塞斯達(dá)的國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH），跟隨尼倫伯格（M.W.Nirenberg，1968年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）開展研究。尼倫伯格已從遺傳密碼研究轉(zhuǎn)向神經(jīng)科學(xué)，但吉爾曼對此無太大興趣，相反還在繼續(xù)自己當(dāng)初的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究，最終開發(fā)成功一種簡單、敏感的cAMP檢測方法，從而為更深入研究這種第二信使分子提供了巨大的便利，被許多研究人員廣泛采用。

1971年，吉爾曼成為弗吉尼亞大學(xué)（University of Virginia）藥理學(xué)助理教授，繼續(xù)開展cAMP方面的工作。由于對cAMP已有較多研究，但是對腺苷酸環(huán)化酶的認(rèn)識相對較少，因此吉爾曼決定對這種定位于細(xì)胞膜上的酶完成純化，以便更好地研究其調(diào)節(jié)機制。吉爾曼純化腺苷酸環(huán)化酶的基本思路是：首先將細(xì)胞各組分拆開，然后重新組裝以確定各組分的功能，通過這種方法來分離。其實，許多人都對該問題進行了嘗試，但由于這種酶在細(xì)胞內(nèi)豐度低、分子量大、穩(wěn)定性差而且是疏水性跨膜蛋白等原因，用傳統(tǒng)生物化學(xué)方法很難達(dá)到目的，只可間接開展研究。吉爾曼的努力最終亦未獲成功。就在科研工作遇阻幾近停滯、吉爾曼感到一籌莫展之時，一個偶然的突破帶來了重大轉(zhuǎn)機。

遇見“貴人”

早期的第二信使假說模型認(rèn)為，激素直接激活腺苷酸環(huán)化酶生成cAMP，但是1960年代的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，感知激素的是一類存在于細(xì)胞膜上的受體，而腺苷酸環(huán)化酶只負(fù)責(zé)cAMP的生成，兩者各司其職。此時的一個重要問題是：受體和腺苷酸環(huán)化酶之間如何實現(xiàn)信號的整合？

美國國立環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所（National In stitute of Environmental Health Sciences，NIEHS）的羅德貝爾（M.Rodbell）根據(jù)計算機和生物體信息加工方面的相似性，提出了自己的假說：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程需要三大類基本元件，即識別器（discriminator）、轉(zhuǎn)導(dǎo)器（transducer）和放大器（amplifier），其中識別器是指受體，放大器是指腺苷酸環(huán)化酶。轉(zhuǎn)導(dǎo)器則是羅德貝爾提出的假想概念，指介導(dǎo)兩類分子的必要成分。羅德貝爾隨后用一系列精細(xì)巧妙的實驗證實，在激素誘導(dǎo)cAMP生成的過程中，除ATP外還需要GTP。他據(jù)此認(rèn)為轉(zhuǎn)導(dǎo)器客觀存在，并且激活轉(zhuǎn)導(dǎo)器需要GTP參與，因此將這種轉(zhuǎn)導(dǎo)器稱為GTP結(jié)合蛋白質(zhì)，簡稱G蛋白。羅德貝爾的G蛋白概念最初并未得到科學(xué)界認(rèn)可，但隨著大量證據(jù)的出現(xiàn)。G蛋白的存在已成為一個客觀事實。只是對這種物質(zhì)的具體特性尚不得而知，解決的關(guān)鍵是將其純化。

吉爾曼也很快意識到G蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性，鑒于對腺苷酸環(huán)化酶的研究不順利，就把注意力轉(zhuǎn)向這種新興分子。吉爾曼采用類似腺苷酸環(huán)化酶的純化策略來研究G蛋白，亦未獲理想結(jié)果，研究再一次陷入困境。

1975年，加州大學(xué)舊金山分校的湯姆金斯（G.Tomkins）和助手篩選獲得一個小鼠淋巴瘤突變細(xì)胞系S49，當(dāng)用激素處理該細(xì)胞時，細(xì)胞無法合成cAMP，因此他們推測，該細(xì)胞系的腺苷酸環(huán)化酶基因發(fā)生了突變。

原本就研究腺苷酸環(huán)化酶的吉爾曼對這個結(jié)果極為感興趣，很快從湯姆金斯實驗室獲得了$49細(xì)胞系。幸運的是一位優(yōu)秀博士后此時也加入了他的研究團隊——羅斯（E.Ross）的最大興趣在于用遺傳學(xué)方法研究膜生物學(xué)問題，腺苷酸環(huán)化酶突變系統(tǒng)的篩選成功深深吸引了他，于是申請到湯姆金斯實驗室，遺憾的是湯姆金斯突然辭世，使羅斯不得不重新選擇，而研究腺苷酸環(huán)化酶的吉爾曼實驗室就成了他的最佳去處。羅斯的加入對吉爾曼的后續(xù)研究工作可謂天助，一方面羅斯本人直接取得了重大突破，另一方面羅斯還游說多位有才學(xué)的年輕人加入吉爾曼的團隊。

純化G蛋白分子

羅斯和吉爾曼決定對S49細(xì)胞系展開全面研究，首先需要知道這種細(xì)胞系cAMP生成障礙的根本原因。羅斯等人用腺苷酸環(huán)化酶激活劑直接處理突變細(xì)胞即可正常生成cAMP，意味著腺苷酸環(huán)化酶功能正常；而突變細(xì)胞與激素的受體動力學(xué)分析表明，細(xì)胞擁有完整的受體；但是用激素處理突變細(xì)胞就無法生成cAMP。結(jié)合羅德貝爾的信號模式可知，唯一異常的可能是轉(zhuǎn)導(dǎo)器，即G蛋白的損害破壞了受體與酶之間的連接。這一發(fā)現(xiàn)具有重要價值，S49細(xì)胞系提供了G蛋白測試的理想體系。

1977年羅斯等人發(fā)現(xiàn)，將正常細(xì)胞提取液加入S49細(xì)胞系后，可恢復(fù)激素誘導(dǎo)cAMP生成的能力，說明這種突變細(xì)胞有缺陷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得到了彌補。在此測試體系基礎(chǔ)上，吉爾曼小組利用層析方法從兔肝臟細(xì)胞膜提取物中純化了這種推測的調(diào)節(jié)成分，電泳顯示是一種多亞基復(fù)合物，最初鑒定出Ⅸ亞基（45kDa；1kDa=1000u）和B亞基（35kDa），進一步研究又鑒定出γ亞基（10kDa）。吉爾曼小組還揭示了以上調(diào)節(jié)分子的作用機制。在未激活前，復(fù)合物以70kDa形式存在，激活后則減少為50kDa，提示激活過程中存在亞基分離的現(xiàn)象。

今天我們知道，G蛋白由α、β和γ三個亞基組成，因此又稱異三聚體G蛋白。激素和受體結(jié)合導(dǎo)致G蛋白α亞基結(jié)合的鳥苷二磷酸（GDP）被GTP替換，這種替換使得僅亞基與β、γ亞基分離。α亞基可激活腺苷酸環(huán)化酶生成cAMP，以啟動下游反應(yīng)，隨后α亞基可將GTP水解為GDP，再與β、γ亞基結(jié)合，從而恢復(fù)初始狀態(tài)。

吉爾曼小組還初步解釋了霍亂的發(fā)生機制?；魜y毒素可與G蛋白的α亞基結(jié)合，損傷其水解GTP的能力，而G蛋白持續(xù)激活會破壞水和鹽從腸道的吸收，最終引發(fā)嚴(yán)重脫水。

G蛋白的發(fā)現(xiàn)還解釋了薩瑟蘭以前發(fā)現(xiàn)的氟離子對cAMP生成的促進效應(yīng)（最初認(rèn)為作用位點在腺苷酸環(huán)化酶上）。原來，氟離子和鋁離子形成AIF₄^-，這種物質(zhì)可與G蛋白α亞基的GDP形式結(jié)合，并引起β、γ亞基分離，激發(fā)腺苷酸環(huán)化酶，增加cAMP的含量。

產(chǎn)生巨大影響

G蛋白的發(fā)現(xiàn)為生命科學(xué)研究開創(chuàng)了一個全新的領(lǐng)域。人們隨后發(fā)現(xiàn)，生物界廣泛存在G蛋白，僅人體內(nèi)就有35個G蛋白基因，其中16個編碼α亞基，5個編碼β亞基，14個編碼γ亞基。G蛋白擁有廣泛的生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)G蛋白的受體被命名為G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptor，GPCR），介導(dǎo)了細(xì)胞中最為重要和多樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。細(xì)胞通過受體感受外界信息，經(jīng)過G蛋白集合與轉(zhuǎn)化后激發(fā)第二信使的生成，繼而誘發(fā)下游信號事件，最終做出應(yīng)答反應(yīng)，在廣泛的細(xì)胞生理過程中起關(guān)鍵作用。G蛋白能夠有機地將外界信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號而執(zhí)行“信息換能器”的功能，因此一旦G蛋白功能紊亂，必然導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，包括霍亂、糖尿病、腫瘤和酒精中毒等。從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)角度看，G蛋白的發(fā)現(xiàn)不僅完善了對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識，也闡明了許多疾病之發(fā)生機制，為治療奠定了基礎(chǔ)。此外，G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程在大量生物物種和生物個體的大多數(shù)臟器組織中存在，因而除醫(yī)學(xué)外還有更多的生命科學(xué)研究涉及G蛋白作用機制，如神經(jīng)生化和藥理、植物及微生物生理生化等。G蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體成了生命科學(xué)研究者們耳熟能詳?shù)脑~匯。

由于純化G蛋白分子的卓越貢獻，吉爾曼于1984年獲加拿大的蓋爾德納基金會國際獎（Gairdner Foundation International Award），1986年當(dāng)選美國科學(xué)院院士，1989年又分享具有諾貝爾獎“風(fēng)向標(biāo)”之稱的美國拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎，最終于1994年和羅德貝爾分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

留下豐碩成果

1981年，受生物化學(xué)家布朗（M.S.Brown.1985年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）之邀，吉爾曼加入達(dá)拉斯的得克薩斯大學(xué)（University of Texas）西南醫(yī)學(xué)中心成為藥理系教授，2005年升為藥理系主任。

吉爾曼對新的工作環(huán)境十分滿意，在這里繼續(xù)完善G蛋白調(diào)節(jié)機制的研究，先后純化了多種G蛋白亞型，發(fā)現(xiàn)了多種α亞基修飾方式等，還獲悉了G蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，從而在分子層面上對G蛋白的激活機制有了更詳細(xì)的理解。在分析G蛋白α亞基GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的時候，意外發(fā)現(xiàn)它們與一種癌蛋白Ras的結(jié)構(gòu)域有高度的同源性，從而發(fā)現(xiàn)一類新的G蛋白，即小G蛋白，它們不參與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而是在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)特定分子活性，由此揭示了一種癌癥發(fā)生的新機制。

吉爾曼仍對早期腺苷酸環(huán)化酶研究念念不忘，經(jīng)過近20年未取得明顯進展之后，隨著分子克隆技術(shù)的發(fā)展，這個問題得到了有效解決。吉爾曼團隊在鑒定出一種二萜化合物可有效結(jié)合腺苷酸環(huán)化酶的基礎(chǔ)上，于1989年利用親和層析從小牛大腦組織純化了這種酶；在獲取部分氨基酸片段基礎(chǔ)上，再借助基因克隆和測序技術(shù)，獲得基因全長，從而揭開這種分子的神秘面紗。這是一種12次跨膜的酶，具有極為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，既包含G蛋白調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，又含有酶的催化結(jié)構(gòu)域，多個跨膜結(jié)構(gòu)也發(fā)揮了不同的效應(yīng)。該酶的純化一方面有助于理解G蛋白調(diào)節(jié)cAMP的生成機制，另一方面也有利于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。

吉爾曼還子承父業(yè)，參與《治療藥理學(xué)基礎(chǔ)》一書的多次修訂和再版。在扎克去世后，吉爾曼繼續(xù)擔(dān)任編纂者，將此書多次再版，及時把藥理學(xué)的最新知識和進展收錄進來，書名亦改為《古德曼與吉爾曼治療藥理學(xué)基礎(chǔ)》（Goodman&Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics）。此書邀集了許多著名的藥理學(xué)家和臨床醫(yī)生擔(dān)任撰稿工作，從而為許多學(xué)生和研究人員了解與熟悉藥物提供了全面資訊。

吉爾曼對科學(xué)研究也有自己的獨特見解，如不建議培養(yǎng)太多研究人員，而主張多培訓(xùn)熟練技術(shù)人員，以保證實驗室各項工作有序推進。他推崇小型實驗室研究，因為大多數(shù)科學(xué)突破往往產(chǎn)生于“小作坊”的研究模式。他批評當(dāng)前平庸的科研過多，而隨著雜志數(shù)量日益增加，此種趨勢日趨嚴(yán)重，等等。他還非常重視科學(xué)發(fā)現(xiàn)過程中的“意外事件”，認(rèn)為當(dāng)“幸運之神”降臨之時，應(yīng)當(dāng)毫不遲疑地去擁抱，充分利用其科學(xué)價值。這些看法值得今天許多生命科學(xué)研究者借鑒。

不幸的是吉爾曼后來被診斷出較難治的胰腺癌，于2015年12月23日在達(dá)拉斯的家中去世，享年74歲。西南醫(yī)學(xué)中心主任波多爾斯基（D.Podolsky）認(rèn)為，吉爾曼是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的天才，他在G蛋白純化及調(diào)節(jié)機制方面的發(fā)現(xiàn)，具有里程碑意義，為多個學(xué)科的發(fā)展開辟了新的研究方向。

吉爾曼一生發(fā)表論文200多篇，主要圍繞G蛋白和腺苷酸環(huán)化酶及第二信使cAMP展開，從而將跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提升到一個新高度，為推動細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展做出了卓越貢獻。其參與編著的藥理學(xué)著作亦對醫(yī)學(xué)人才的培養(yǎng)產(chǎn)生了重要影響。