王爽 曹宏偉 張春磊

摘 要：本文以金黃色葡萄球菌腸毒素為研究對象，擴增出的三個融合毒素SEA、SEB、SEE進行基因串聯(lián)后，得到的融合毒素基因在表達宿主菌中得到了充分的表達，融合毒素具有良好的抗原性，抗體可以和三種融合毒素產(chǎn)生免疫反應(yīng)，特異性較好。從而得出結(jié)論：將金黃色葡萄球菌腸毒素的擴增基因進行串聯(lián)可以在原核中表達，表達后可以產(chǎn)生具有廣譜反應(yīng)特性的抗體。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；融合毒素；免疫特性

金黃色葡萄球菌腸毒素是一種會引起食物中毒的細(xì)菌毒素，食品污染上這種細(xì)菌后會腐爛變質(zhì)，嚴(yán)重時產(chǎn)生的腸毒素會導(dǎo)致食物中毒。在進行這種毒素的檢測時，最開始是通過將菌體分離，確定是不是產(chǎn)毒株，最后判斷產(chǎn)生毒素的方法，這種方法程序比較繁雜，不夠節(jié)省時間，不能滿足快速進行食品檢測的要求。隨著生物技術(shù)發(fā)展，進行食物中毒樣品的檢測分析方法越來越多，例如單克隆抗體技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)等，這些檢測技術(shù)得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

金黃色葡萄球菌腸毒素的基因毒素現(xiàn)在都可以克隆表達出來，例如A、B、E型的基因，本文分析的就是這三種基因的融合表達和免疫特性，從而為食品廣譜免疫學(xué)檢測方法提供一些方法方面的基礎(chǔ)。

一、金黃色葡萄球菌簡介

金黃色葡萄球菌又稱為金葡菌SA，因在顯微鏡下呈葡萄串形而得然。金黃色葡萄球菌沒有芽胞和鞭毛，其生長對營養(yǎng)方面的要求不高。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，分以分解為葡萄糖 、麥芽糖、乳糖等，它具有較強的抵抗力，對青霉素、紅霉素非常敏感。

金黃色葡萄球菌可引起人類的化膿感染，有時還會引起肺炎、心包炎等。金黃色葡萄球菌的致病力的強弱主要取決于它產(chǎn)生的毒素和侵襲性的酶，如溶性毒素、殺白細(xì)胞素、血漿凝固酶、腸毒素等。金黃色葡萄球菌可以分泌20多種特性的蛋白質(zhì)，最主要的是葡萄球菌腸毒素（SE），是由血漿凝固酶或者耐熱酸酶產(chǎn)生的一種胞外蛋白質(zhì)，根據(jù)血清類型分為A—J幾種，這些腸毒素都可以引起食物中毒。下面來對金黃色葡萄球菌三聯(lián)整合毒素進行表達并進行免疫特性分析。

二、金黃色葡萄球菌腸毒素基因片段的克隆

利用PCR檢測方法擴增出SEA、SEB、SEE，后與載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入克隆菌，提取質(zhì)粒的DNA，成功克隆了SEA、SEB、SEE的結(jié)構(gòu)基因，對結(jié)構(gòu)基因進行電泳分析，在紫外線檢測儀下觀察到了非常明顯的特異性條帶，片斷分別為SEA、SEB、SEE，片斷的大小與已經(jīng)存在的標(biāo)準(zhǔn)序列是相符的，沒有發(fā)生突變，也未發(fā)生缺失突變，將三種毒素的基因序列克隆后進行酶切定和序列的測定分析，測定結(jié)果與文獻結(jié)果的同源性全部一致，目的基因轉(zhuǎn)入了受體菌中。

三、三個基因的串聯(lián)表達

將克隆出來的基因片斷SEA、SEB、SEE重疊延伸拼接法進行串聯(lián)，獲得了一條三個基因串聯(lián)的肽鏈，與PET連接后用PET在原核中進行載體表達 ，測定結(jié)果顯示串聯(lián)的三個毒素在大腸肝菌中獲得了表達，原核表達載體構(gòu)建后轉(zhuǎn)化到了受體菌，經(jīng)過誘導(dǎo)和凝膠電脈后獲得了表達蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)大小為64KU，原核表達載體可以表達較大的蛋白 ，但如果是以包涵體的形式表達，蛋白表達量更高，多個基因串聯(lián)對蛋白表達的大小會有影響。表達產(chǎn)物的表達形成可以達到26%，并探討了不同的誘導(dǎo)條件對表達效果會產(chǎn)生不同的影響，如果IPTG的濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)時間達到4個小時，這時的表達效果是最好的。

四、三聯(lián)重組毒素的抗原性分析

將表達蛋白的包涵體進行純化，從獺兔身上制備血清抗體，經(jīng)過瓊脂擴散試驗顯示，表達的融合毒素基因有不同的抗體效價，但是保留了A、B、E三種毒素的抗原性，和非目標(biāo)菌和毒素不會反應(yīng)，具有特異性。包涵體沒有生物學(xué)活性，但會保留免疫學(xué)的性質(zhì)，用包涵體免疫獺兔作試驗，產(chǎn)生了抗體，抗體與相應(yīng)的毒素蛋白會起反應(yīng)，但它具有特異性，所以這種包涵體可以作為制備細(xì)菌毒素的抗體，這樣可以節(jié)約毒素或毒素替代品的使用量。在原核的表達載體中可以進行3個以上蛋白基因的串聯(lián)，產(chǎn)生的抗體可以具備廣譜抗體的意義，從而為廣譜免疫檢測方法的建立 提供了理論依據(jù)。

五、小結(jié)

通過對金黃色葡萄球菌SEA、SEB、SEE三個毒素基因片斷的成功克隆，得到了與文獻報道結(jié)果100%同源性的測序結(jié)果，將這三個毒素基因進行串聯(lián)，構(gòu)建起了三聯(lián)毒素重組基因，從而充分說明了可以在原核表達載體中串聯(lián)至少3個蛋白基因，2個連接基因，每年抗原可以保持原有的特性。原核表達載體以包涵體的形式進行表達 ，表達量占到了菌體總蛋白量的26%，測量了少部分的可溶性蛋白。初步提純的包涵體可以誘導(dǎo)獺兔產(chǎn)生免疫的抗體。對三種毒素的敏感性進行測定，三種毒素都達到了ng水平，其中SEB毒素的敏感性較高。

參考文獻：

[1] 雷祚榮.葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病[M].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1992.第一版.

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[3] 汪宇.金黃色葡萄球菌腸毒素A基因全序列的克隆、鑒定與擴增.貴州醫(yī)藥，2003，27（8）：675-678.

項目名稱：《金黃色葡萄球菌CIfB/Lbp嵌合蛋白免疫原性研究》，項目編號：11541251，黑龍江省教育廳科研項目

作者簡介：王爽（1982-），女，漢族，黑龍江人，職稱：研究實習(xí)員，職務(wù)：檢測員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。