賀建忠+陳宏偉+王貴強(qiáng)+王永+白萬勝+郭新懷+王勇

摘要：以分離自全國9個(gè)?。ㄊ?、區(qū)）的102株奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌為研究對象，應(yīng)用剛果紅法（congo red agar，CRA）和半定量黏附試驗(yàn)（semi quantitative adherence assay，SQAA）檢測了生物被膜形成情況，應(yīng)用PCR法檢測了8種生物被膜相關(guān)基因分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶7種基因的菌株占有絕對優(yōu)勢，其次是攜帶6種基因的菌株;最流行的基因組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高達(dá)66.7%;北京、內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、廣西、上海等地生物被膜形成與生物被膜相關(guān)基因的分布高度一致。以上研究結(jié)果表明，多種生物被膜相關(guān)基因組合是奶牛乳房炎源性金黃色葡萄球菌流行的主要特點(diǎn)，生物被膜形成和生物被膜相關(guān)基因的分布在大多數(shù)地區(qū)表現(xiàn)高度一致性，rbf和SigB基因可能在金黃色葡萄球菌生物被膜形成和乳房感染過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果將為金黃色葡萄球菌性乳房炎的防治提供一定的科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌;生物被膜;奶牛乳房炎;生物被膜相關(guān)基因

中圖分類號： S852.61+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0055-04

收稿日期：2014-04-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金（編號：31260628）;塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號：HS201204）。

作者簡介：賀建忠（1977—），男，內(nèi)蒙古五原人，碩士，副教授，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。E-mail：talimuhe_he@126.com。

通信作者：白萬勝，副教授，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。E-mail：bwsdky@126.com。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是奶牛乳房炎（bovine mastitis）的主要病原之一，防治困難，常給乳業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。SA易形成生物被膜（biofilm，BF），BF對抗生素治療以及宿主免疫均可產(chǎn)生較強(qiáng)的抵抗力，因此被認(rèn)為是乳房炎發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要毒力因子[1-2]。生物被膜形成受多種基因調(diào)控，這些調(diào)控基因統(tǒng)稱為生物被膜相關(guān)基因（biofilm-associated genes，BAGs）。例如icaA和icaD的表達(dá)可促進(jìn)BF的形成[3]，icaR通過抑制ica的轉(zhuǎn)錄而抑制BF的形成。此外，rbf、bap、sarA、SigB和SasG等均可直接或間接調(diào)節(jié)BF的形成。

對于BF形成及BAGs分布多有報(bào)道，但對于BF形成和BAGs關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道。為此，本研究以全國9個(gè)省（區(qū)）102株SA為研究對象，進(jìn)行了BF及BAGs分布情況調(diào)查，旨在分析地域性差異，為SA性發(fā)乳房炎的進(jìn)一步防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株背景 102株SA均分離自亞臨床性乳房炎乳樣。菌株為本實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存。鑒定程序包括溶血性觀察、革蘭氏染色、觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)、生化鑒定及SA特異性基因nuc的PCR檢測等。鑒定后的菌株在含20%甘油的 Luria-Bertani（LB）肉湯中于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

菌株分離自全國9個(gè)?。ㄊ小^(qū)），共102株，其中河北省37株、北京市14株、內(nèi)蒙古自治區(qū)7株、甘肅省7株、寧夏自治區(qū)11株、新疆維吾爾自治區(qū)7株、河南省6株、上海市5株、廣西壯族自治區(qū)7株。

1.1.2 主要試劑與儀器 胰蛋白胨大豆胨肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、腦心侵液（BHI）瓊脂/肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，剛果紅購自天津科密歐試劑有限公司，蔗糖購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）分別購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和北京化學(xué)試劑有限公司，瓊脂糖、Taq mix和Marker購自北京艾德萊生物科技有限公司，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

臺式微量高速離心機(jī)（TG-16S）：四川蜀科儀器有限公司;氣浴恒溫振蕩器（THZ-82A）：金壇市醫(yī)療儀器廠;數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（HPX-9052MBE）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電泳儀（DYY-6D）：北京市六一儀器廠;凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon-4100）：上海天能科技有限公司;DNM-9602酶標(biāo)分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BF檢測 剛果紅法（congo red agar，CRA）：將36 g蔗糖和0.8 g剛果紅溶于1 L腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）中，121 ℃高壓滅菌15 min，傾倒平板（CRA平板），備用。挑取復(fù)蘇后的單菌落接種于CRA平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。凡粗糙、干燥、水晶樣的黑色菌落均為生物被膜陽性株（biofilm-positive strains）;而紅色的光滑型菌落為生物被膜陰性株（biofim-negative strains）。

半定量黏附試驗(yàn)（semi-quantitative assay，SQAA）：挑取復(fù)蘇后的單菌落接種于BHI肉湯，37 ℃恒溫振蕩器中過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)的BHI肉湯，用含20 g/L葡萄糖的BHI肉湯按1 ∶ 100的比例稀釋。用微量移液器吸取200 μL稀釋后的菌液轉(zhuǎn)移到96孔板。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以BHI肉湯作陰性對照。將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將96孔板中的液體移除，用PBS液清洗2遍，以除去剩余的浮游菌。倒置自然干燥后，加入100 μL 95%乙醇固定 5 min，再用100 μL 1%結(jié)晶紫染色5 min。染色后，用滅菌蒸餾水清洗3遍，以除去剩余的染液。自然干燥后，用酶標(biāo)儀測定570 nm下的D值。凡D570 nm≥0.1的為生物被膜陽性株，D570 nm<0.1的為生物被膜陰性株。D值取3組的平均值。

1.2.2 BAGs檢測 按照索萊寶細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提供的步驟進(jìn)行。提取的DNA模板保存于-20 ℃冰箱中備用。8個(gè)生物被膜形成相關(guān)基因（icaA、icaD、icaR、sigB、sarA、bap、rbf、sasG）采用PCR法進(jìn)行檢測，引物序列、退火溫度、產(chǎn)物大小及參考文獻(xiàn)見表1。PCR反應(yīng)體系（20 μL）分別含有1 μL上下游引物、7 μL ddH2O、10 μL Taq Mix和1 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 預(yù)變性8 min;95 ℃ 變性30 s，相應(yīng)的退火溫度（表1）退火30 s，72 ℃ 延伸10 min，30個(gè)循環(huán)。含0.5 μg/mL溴乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，PCR產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

表1 引物設(shè)計(jì)

基因 引物序列（5′→3′） Tm

（℃） 目的片段長度

（bp） 參考文獻(xiàn)

icaA CCTAACTAACGAAAGGTAG;AAGATATAGCGATAAGTGC 56 1 315 [4]

icaD ATGGTCAAGCCCAGACAGG;CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA 56 198 [5]

bap CCCTATATCGAAGGTGTAGAATTG;GCTGTTGAAGTTAATACTGTACCTGC 60 971 [6]

icaR CAATAATCTAATACGCCTGAG;AGTAGCGAATACACTTCATCT 54 246 [5]

sarA TTTTTTTACGTTGTTGTGCATTAACA;CATTTAAACTACAAACAACCACAAGTTG 56 135 [7]

rbf ACGCGTTGCCAAGATGGCATAGTCTT;AGCCTAATTCCGCAAACCAATCGCTA 62 164 [8]

SasG CGGATCCGGTGTGACAATCAGTATGAC;CGGAATTCGCGACATTTATGTGGATACAC 55 937 [9]

2 結(jié)果與分析

2.1 BAGs的分布情況

BF相關(guān)基因廣泛分布于乳房炎性SA分離株中，所有的102株SA至少攜帶1種BAG。相比較而言，同時(shí)存在7種基因的菌株最多，所有菌種陽性菌株Total（t）、CRA檢測BF陽性菌株CRA（+）、SQAA檢測BF陽性菌株SQAA（+）、CRA和SQAA檢測均為陽性的菌株CRA（+）& SQAA（+）比例分別為66.7%、725%、65.3%、63.6%。其次，同時(shí)攜帶6種基因的菌株較多，且SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）比例最高。所有被測菌株均未擴(kuò)增出bap基因，因此沒有同時(shí)存在8種被測基因的菌株。

本研究共檢測了8種BF相關(guān)基因，出現(xiàn)的組合形式共20種，其中比例最高的是7種基因的組合，最少的僅有1種基因存在。最流行的組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高達(dá)66.7%;SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-rbf-SasG的比例分別是6.9%、3.9%、2.9%、29%、2.0%、2.0%;其余組合均為1.0%，即組合形式僅出現(xiàn)1次（表2）。

表2 BF相關(guān)基因組合的流行情況

相關(guān)基因組合

SigB icaR icaA icaD sarA rbf SasG

比例

（%）

+ + + + + + + 66.7

+ + + - + + + 6.9

+ - + + + + + 3.9

+ + - + + + + 2.9

+ - - - - - - 2.9

- + + + + + + 2.0

+ - + - - + + 2.0

- + - - - - - 1.0

- - - - - + + 1.0

+ - - - - + - 1.0

+ - - + - + - 1.0

+ - - + - + + 1.0

+ + + - - + - 1.0

+ - - + + + - 1.0

- - + + - + + 1.0

+ - + - + + + 1.0

+ + + - + + - 1.0

- + + + - + - 1.0

+ + + + + - + 1.0

+ + + + + + - 1.0

2.2 BF的檢測結(jié)果

由圖2可以看出，河北省BF陽性株BAGs的比例均低于菌株總數(shù)。寧夏和甘肅BF陽性株BAGs的比例均高于或等于菌株總數(shù)，而且SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）全部為100%，說明BAGs和SQAA+存在完全的一致性。除了北京市的icaD基因和內(nèi)蒙古的icaR基因，這2個(gè)地區(qū)BAGs在SQAA（+） 和 CRA（+）& SQAA（+）中均高于或等于菌種總

數(shù)中的比例。新疆除SigB和rbf2個(gè)基因外，其他的變化趨勢與河北相似。

由圖3可以看出，河南BAGs在CRA（+）和菌株總數(shù)中的比例全部相同，BAGs在SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）中的比例也全部相同。廣西和上海BAGs在SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）中均為100%，BAGs分布與BF形成表現(xiàn)出很好的一致性。就全國范圍總體而言，CRA（+）中BAGs的比例均高于菌種總數(shù)和其他BF陽性株，說明CRA（+）在全國范圍內(nèi)與BAGs的符合度較高。

3 討論

SA是引發(fā)臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎最主要的病原之一[10]，可降低牛奶質(zhì)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是影響奶業(yè)發(fā)展的主要問題[11]。SA具有多種毒力因子，其中BF形成被認(rèn)為是引發(fā)慢性感染的主要原因[12]。BF的形成與BAGs的分布密不可分，本研究結(jié)果顯示，BF陽性株均存在較高比例的BAGs，其中同時(shí)存在7種和6種被測基因的占有絕對優(yōu)勢。在20種流行組合中，最流行的組合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高達(dá)66.7%，其次是SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG（6.9%）、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG（3.9%）、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG（29%）、SigB（2.9%）、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG（2.0%）和SigB-icaA-rbf-SasG（2.0%）。以上結(jié)果表明，多種BAGs組合是我國乳房炎性SA流行的重要特征之一，同時(shí)這些基因可能在BF形成過程發(fā)揮重要作用。icaA和icaD共同表達(dá)增加N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性，促進(jìn)BF的形成[13]，而icaR可通過限制ica表達(dá)抑制BF的形成。SigB、rbf與SasG的表達(dá)能夠促進(jìn)BF的形成[14-16]，而SarA的表達(dá)能夠限制BF的形成[17]，迄今，盡管bap基因表達(dá)能夠促進(jìn)SA在乳房內(nèi)的黏附和BF的形成[18]，但是在本研究所有被測菌株中均未擴(kuò)增出該基因，說明該基因在我國乳房炎性金黃色葡萄球菌BF形成和發(fā)病機(jī)制中居于次要地位。

不同地區(qū)BF形成與BAGs分布的一致性存在一定差別。廣西、上海、北京、內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅7個(gè)省（市、區(qū)） BAGs分

布BF形成保持高度一致性，而河北、河南和新疆BAGs分布和BF形成的一致性相對降低，提示在BF形成和乳房炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的可能是本研究未檢測的某些基因。具體到基因種類，rbf和SigB分布最廣，在大多數(shù)省份均為100%，提示這2個(gè)基因在SA性乳房炎發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。Rbf可抑制icaR的表達(dá)，能夠間接激活icaADBC的表達(dá)，促進(jìn)BF的形成，但是并不依賴于ica通路[16]。sigB能夠促進(jìn)不同毒力因子表達(dá)的調(diào)控，促進(jìn)BF形成的同時(shí)能夠調(diào)節(jié)抗生素耐藥性[19]。因此，通過rbf和SigB基因功能調(diào)節(jié)入手，研究我國乳房炎性SA的致病機(jī)制，可能是一種新的思路。

綜上所述，多種BAGs組合流行是我國乳房炎性SA流行的主要趨勢，各地區(qū)金黃色葡萄球菌BF形成和BAGs分布存在一定的差異。

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