葛愛民

摘要： 對(duì)寵物門診分離得到的25株金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性分析與β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定，以了解近3年來(lái)濰坊地區(qū)犬源金黃色葡萄球菌的耐藥性及其是否產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，以期為臨床上致病性金黃色葡萄球菌感染的有效控制提供依據(jù)。使用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；使用碘量法、酚紅法測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生。25株金黃色葡萄球菌對(duì)替考拉寧、利福平、萬(wàn)古霉素十分敏感，對(duì)其他25種藥物呈現(xiàn)一定耐藥性，并對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素呈現(xiàn)很高的耐藥性。碘量法、酚紅法測(cè)得產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株分別為18、17株。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧不具有耐藥性，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素基本具有耐藥性；不產(chǎn)酶的菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性低于產(chǎn)酶菌株?？梢姡?內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性的主要原因。

關(guān)鍵詞： 犬；金黃色葡萄球菌；耐藥性；β-內(nèi)酰胺酶

中圖分類號(hào)： S858 292 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0219-02

犬源金黃色葡萄球菌感染可導(dǎo)致膿皮病、外耳炎、角膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等 [1]，是較為常見的寵物犬臨床細(xì)菌感染。由于近年來(lái)抗生素的過(guò)度使用，金黃色葡萄球菌耐藥性的問(wèn)題始終困擾著臨床用藥。為了解犬源致病性金黃色葡萄球菌在濰坊地區(qū)的耐藥特性，對(duì)近3年寵物門診分離得到的25株致病性金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性研究，為臨床醫(yī)師合理選用抗生素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 材料

1 1 1 菌種 25株致病性金黃色葡萄球菌分離自山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院及周邊寵物門診的犬臨床病例。

1 1 2 試劑 牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、淀粉購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；常用藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；碘、碘化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購(gòu)自西隴化工股份有限公司；酚紅購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；注射用青霉素鈉購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。按常規(guī)方法自制培養(yǎng)基、碘液、酚紅溶液（5 g/L）指示劑、PBS緩沖液。

1 1 3 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司；電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自江蘇省醫(yī)療器械廠；電子萬(wàn)用爐購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；磁力攪拌器購(gòu)自常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1 2 方法

1 2 1 金黃色葡萄球菌菌種的制備 配制普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，制作斜面25個(gè)，用接種環(huán)取已保藏的25株金黃色葡萄球菌分別接種在斜面上，“之”字形劃線，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。

1 2 2 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備 配制普通肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌后倒在25支試管中（每支試管約2 mL），待液體冷卻后，用滅菌的接種環(huán)在斜面上取少量金黃色葡萄球菌接種至試管內(nèi)，于搖床中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1 2 3 藥敏試驗(yàn) 吸取100 μL菌液至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，將菌液均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，每株金黃色葡萄球菌對(duì)應(yīng)4塊平板，用鑷子將藥敏紙片放置于涂抹好菌液的平板上，每塊平板均勻放置7種藥敏紙片，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)完成后用卡尺測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，記錄試驗(yàn)結(jié)果。藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥23 mm為高敏，抑菌圈直徑在18～22 mm為敏感，抑菌圈直徑在15～17 mm為中敏，抑菌圈直徑在13～14 mm為低敏，抑菌圈直徑≤12 mm為耐藥。

1 2 4 碘量法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生 采用點(diǎn)種法將斜面上的25株金黃色葡萄球菌分別接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基（固體）平板（每塊平板點(diǎn)種4株不同的金黃色葡萄球菌），于37 ℃恒溫過(guò)夜。將淀粉瓊脂上層培養(yǎng)基分裝于試管中，每支9 mL，置于55 ℃恒溫水浴鍋。將1瓶注射用青霉素鈉（800 000 U）溶于40 mL無(wú)菌水中，配成青霉素含量為 20 000 U/mL 的溶液。向每支裝有淀粉瓊脂上層培養(yǎng)基的試管中加入1 mL配好的青霉素溶液，混勻后立即傾注于培養(yǎng)好的平板上，鋪平待凝。吸取碘液鋪滿平板表面，用滴管吸去多余碘液，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置10～15 min后，觀察菌的周圍是否出現(xiàn)無(wú)色透明圈，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1 2 5 酚紅法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生 配制普通肉湯培養(yǎng)基（液體）并分裝于25支試管中，每支試管4 mL。將斜面上的25株金黃色葡萄球菌分別接種在25支試管中，于搖床中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。向1瓶注射用青霉素鈉（800 000 U）中加入1 mL配好的酚紅溶液并混勻。用移液槍分別吸取02 mL青霉素酚紅溶液加入每支待測(cè)菌液試管中，混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)10～15 min，觀察溶液是否由紅色變?yōu)辄S色，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2 1 藥敏試驗(yàn)

25株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，大多數(shù)菌株對(duì)壯觀霉素、青霉素G、羧芐青霉素耐藥，對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧敏感，對(duì)呋喃妥因、克林霉素、紅霉素相對(duì)較為敏感，對(duì)其他各種藥物均有很大程度的耐藥性（表1）。

2 3 酚紅法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生

采用酚紅法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，溶液由紅色變?yōu)辄S色則表明有β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生。結(jié)果顯示，25株金黃色葡萄球菌中有17株可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，產(chǎn)酶率為68%（表3）。

2 4 β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株與陰性菌株的耐藥性

結(jié)果顯示，β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性均非常高，陰性菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性則低一些；對(duì)利福平、萬(wàn)古霉素、替考拉寧耐藥的菌株均產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶（表4）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)的25株金黃色葡萄球菌中，對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧敏感的菌株較多，耐藥率分別為12%、20%、16%，與相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)論 [2-3]基本一致。除上述3種抗生素外，試驗(yàn)菌株對(duì)呋喃妥因、克林霉素、紅霉素也較為敏感，耐藥率分別為48%、56%、60%，與卞聰?shù)鹊难芯拷Y(jié)果 [4]一致。試驗(yàn)菌株對(duì)青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類抗生素的耐藥性均很高，這與分離自不同動(dòng)物和人體的金黃色葡萄球菌的耐藥性研究結(jié)果相符。

細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶來(lái)水解抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使抗生素對(duì)細(xì)菌失去治療效果，這是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的方式之一。碘量法利用β-內(nèi)酰胺酶作用于青霉素，產(chǎn)生裂解酸與淀粉競(jìng)爭(zhēng)游離碘，使藍(lán)色的碘-淀粉復(fù)合物褪色，碘量法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速的優(yōu)點(diǎn) [5]。酚紅法也是利用青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶的作用產(chǎn)生裂解酸，從而改變pH值，使指示劑的顏色發(fā)生變化 [6]。這2種方法均可定性鑒定β-內(nèi)酰胺酶的存在 [4]，本試驗(yàn)碘量法中有72%的菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，酚紅法中則有68%的菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，2種方法測(cè)得的結(jié)果基本相符。由于觀察結(jié)果的時(shí)間、 加入試劑的時(shí)

間、青霉素溶液配制的時(shí)間不同，導(dǎo)致指示劑濃度、待測(cè)菌液濃度有一定差別，使個(gè)別菌株出現(xiàn)不同檢測(cè)方法的差異。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用碘量法和酚紅法測(cè)得的產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶的菌株，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素均有高度的耐藥性；而藥敏試驗(yàn)中對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性的菌株中，也有部分菌株并未產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。可見，產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因，但造成細(xì)菌耐藥性的原因有很多，不單局限于β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，且試驗(yàn)中的操作失誤也可能影響試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果還表明，產(chǎn)酶菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、替考拉寧的敏感程度很高，不產(chǎn)酶菌株對(duì)這3種抗生素完全敏感，且不產(chǎn)酶菌株對(duì)利奈唑胺均無(wú)耐藥性，這與劉小朵的研究結(jié)果 [7]一致。

近年來(lái)寵物市場(chǎng)發(fā)展迅猛，人們對(duì)寵物健康的重視程度非常高，要求門診醫(yī)師能夠憑借經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及時(shí)解決致病性金黃色葡萄球菌等細(xì)菌感染問(wèn)題；因此，研究細(xì)菌的耐藥性對(duì)于臨床合理使用抗生素具有重要指導(dǎo)意義。

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[7]劉小朵 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的金黃色葡萄球菌的耐藥情況分析[J] 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2013，32（21）：138