李桂花 王亭亭 劉凱 陳漢才 張艷 黎庭耀 藍華生

摘 要 對40份芥藍材料進行游離小孢子培養(yǎng)及植株再生研究。結(jié)果表明：不同基因型間胚狀體誘導(dǎo)率差異顯著，其中只有紅腳黃花芥藍×612、孤老種、黃花芥藍、綠寶、香港中花芥藍產(chǎn)生胚狀體；日照時間為11～12 h的供試植株的胚狀體誘導(dǎo)率是日照時間為5～6 h的3～7倍；采用單核靠邊期至雙核早期的小孢子進行胚狀體誘導(dǎo)效果最佳，此時花蕾大小為3.0～4.5 mm；在32.5 ℃下高溫預(yù)處理小孢子24 h誘導(dǎo)效果最佳，其他溫度時間組合條件下胚狀體誘導(dǎo)率降低65%～100%。

關(guān)鍵詞 芥藍；游離小孢子培養(yǎng)；胚狀體誘導(dǎo)率；植株再生

中圖分類號 S635 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Forty varieties of Chinese Kale were isolated for the study of microspore culture and plant regeneration. The results showed that： embryogenic rate among different genotypes was significantly different， among which only red foot flower kale × 612， the solitary species， yellow broccoli， Emerald and Hong Kong flower kale generated embryos； the embryogenic rate of the plant with 11-12 hours of sunshine was 3-7 times of those with 5-6 hours of sunshine； the late unicellular to early dual-core sidelined microspores had the best embryogenic rate when the bud size was 3.0-4.5 mm； the microspore with heat pretreatment at 32.5 ℃ for 24 hours had the best embryoid induction ability， while at other combinations of time and temperature， embryogenic rate decreased 65%-100%.

Key words Chinese Kale； Isolated microspore culture； Percentage of embryogenic； Plant regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.013

芥藍（Brassica alboglabra）是十字花科蕓薹屬的甘藍類蔬菜作物，是中國南方特色蔬菜作物之一[1]。芥藍通過常規(guī)雜交再經(jīng)過連續(xù)自交純化獲得純合品系通常需要5～8 a的時間[2]。而采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得基因型純合的雙單倍體只需要1～2 a時間，遺傳上非常穩(wěn)定，不僅可以縮短育種年限，而且可以提高基因組合選擇效率。小孢子培養(yǎng)是指直接從花蕾或花藥中獲得游離的或新鮮的小孢子群體而進行培養(yǎng)，經(jīng)由胚狀體的誘導(dǎo)，再生出完整的單倍體植株，然后經(jīng)過自發(fā)或誘發(fā)染色體加倍，成為正?？捎?、純合的二倍體植株的過程[3]。影響小孢子培養(yǎng)的因素很多，包括內(nèi)在因素（如供體材料的生理狀況和基因型等）和外部因素（如供體植株生長環(huán)境、取材時間、培養(yǎng)方法等）[4]。張麗等[5]、朱允華等[6]、王超楠[7]分別研究了影響春白蘿卜、菜心、小白菜游離小孢子胚狀體產(chǎn)生的因素。王春麗等[8]、周志國等[9]對蘿卜的游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行了研究，栗根義等[10]、陳曉峰等[11]、張亞麗[12]對大白菜的游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行了研究，均獲得了純合雙單倍體植株。

國內(nèi)外已有許多學(xué)者對十字花科蕓薹屬作物的游離小孢子培養(yǎng)開展了研究。Duijs等[13]和嚴(yán)準(zhǔn)等[14]分別首次報道了抱子甘藍和球莖甘藍游離小孢子培養(yǎng)獲得成功并得到再生植株。邊立娜等[15]、佟智慧[4]分別對青花菜進行游離小孢子培養(yǎng)，研究了影響胚狀體發(fā)生和植株再生的各種因素。張娜等[16]、姜鳳英[17]分別對黃花芥藍、羽衣甘藍胚狀體發(fā)生及植株再生的影響因素進行了探究。對芥藍小孢子培養(yǎng)成功的報道最早在1991年[18]。何杭軍等[19]、趙前程等[20]、Ferrie等[21]先后對芥藍游離小孢子培養(yǎng)中誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生及植株再生進行了探討。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)有助于快速培養(yǎng)出純合品系，但相對于其他蕓薹屬植物而言，目前關(guān)于芥藍游離小孢子培養(yǎng)的報道比較少，還沒有建立普遍適用的方法，無法直接將芥藍種質(zhì)資源中的優(yōu)異種質(zhì)資源進行挖掘與利用。因此，本研究在前人的基礎(chǔ)上進行多個不同芥藍品種游離小孢子培養(yǎng)試驗，利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可創(chuàng)造芥藍純合雙單倍體，加速芥藍育種進程，縮短育種時間。

1 材料與方法

1.1 材料

紅腳黃花芥藍×612、凌桂遲芥藍、孤老種、早35天芥藍筷等40份優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的不同芥藍材料，于2014年9月28日播種于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云基地，如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的種類和保存及小孢子培養(yǎng)過程

將B5液體、固體培養(yǎng)基，MS固體培養(yǎng)基以及1/2MS固體培養(yǎng)基配制完成后置于120 ℃高壓滅菌鍋消毒20 min，冷卻后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩LN液體培養(yǎng)基需在超凈工作臺上用過濾器進行過濾滅菌，分裝在三角瓶中，封口保存。

1.2.2 統(tǒng)計方法 胚狀體誘導(dǎo)率=胚狀體數(shù)/花蕾數(shù)×100%

1.2.3 芥藍游離小孢子培養(yǎng)方法 于晴天上午9：00～10：00采樣，選擇處于盛花期的供體植株采集花蕾，取單核靠邊期的花蕾；用75%乙醇消毒30 s，再用8%次氯酸鈉滅菌15 min，用無菌水沖洗3次，每次5 min；往研缽中加入適量B5液體培養(yǎng)基，用研棒輕輕擠壓花蕾，使小孢子從花藥中游離到B5液體培養(yǎng)基中，重復(fù)2次，每次均取下層沉淀；第3次離心時加入NLN培養(yǎng)基代替B5液體培養(yǎng)基，用NLN培養(yǎng)基分裝于小培養(yǎng)皿中，用封口膜封口。

將封口的培養(yǎng)皿先于32.5 ℃暗培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)至25 ℃繼續(xù)進行暗培養(yǎng)，一般2～3周出現(xiàn)胚狀體；將胚狀體移入MS固體培養(yǎng)基，待形成胚狀體后再轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基中繼代；將繼代后長出的小苗轉(zhuǎn)移至1/2MS固體培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，最終獲得生長健壯的再生植株。

1.2.4 影響芥藍胚狀體誘導(dǎo)率因素的試驗

（1）基因型的影響。采用40份不同的芥藍材料進行游離小孢子培養(yǎng)，每個芥藍材料采100個花蕾，所接培養(yǎng)皿數(shù)為14皿。

（2）供體生理狀況的影響。選擇生長在同一塑料大棚、長勢良好且相近的供體材料，將其中一半植株在每天中午12：00套上白色不透明紙袋（相當(dāng)于日照時間為5～6 h），另一半植株在正常光照條件下生長（相當(dāng)于日照時間為11～12 h）；一個星期后，在處理過的植株與自然受光植株上分別取蕾進行游離小孢子培養(yǎng)，每個芥藍品種采用100個花蕾，所接培養(yǎng)皿數(shù)為14皿。

（3）小孢子發(fā)育時期的影響。分別采用單核早期、單核靠邊期、雙核早期及雙核晚期等4個不同發(fā)育時期的小孢子進行游離小孢子培養(yǎng)，每個芥藍品種采100個花蕾，所接培養(yǎng)皿數(shù)為14皿。

（4）高溫預(yù)處理的影響。將培養(yǎng)皿分裝完成后分別置于25、30、32.5、35 ℃ 4種不同溫度下處理24 h，在32.5 ℃溫度條件下分別處理24、48、72 h，每個芥藍品種采用100個花蕾，所接培養(yǎng)皿數(shù)為14皿。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體基因型對小孢子胚狀體狀體發(fā)生的影響

2.1.1 不同基因型芥藍胚狀體誘導(dǎo)率 試驗結(jié)果如表2所示，不同基因型的芥藍胚狀體誘導(dǎo)率存在很大差異。在用于游離小孢子培養(yǎng)的40份不同基因型芥藍材料中，有5份材料成功產(chǎn)生胚狀體，分別是紅腳黃花芥藍×612、孤老種、黃花芥藍、綠寶和香港中花芥藍。這5份材料的胚狀體誘導(dǎo)率也相差較大，最高胚狀體誘導(dǎo)率達52%，最低胚狀體誘導(dǎo)率為10%。而遲花芥藍、紅腳芥藍、四季粗條等35種芥藍皆沒有產(chǎn)生胚狀體?？梢娀蛐蛯嫠{胚狀體誘導(dǎo)率有重大影響。圖1-A～F為芥藍游離小孢子培養(yǎng)中從誘導(dǎo)出胚狀體到形成再生植株的過程。

2.1.2 芥藍小孢子培養(yǎng)的植株倍性鑒定 對培養(yǎng)出來的植株，在移栽前用醋酸洋紅染色法進行倍性鑒定。取100 mL 45%醋酸加熱至沸，移去火源，加入1 g洋紅，加熱回流2～24 h，過濾，加幾滴2%的鐵明礬，制成1%醋酸洋紅；取少許根尖于載玻片上，加1～2滴醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片；將制片放在顯微鏡下觀察。從圖2最左側(cè)一個細胞中可以看出染色體條數(shù)為9，而芥藍是屬于十字花科蕓薹屬CC染色體組，染色體為2n=18，9條染色體說明該植株是單倍體，用0.1%的秋水仙堿浸根10 h，再移栽至田間或花盆中栽培。

2.2 供體生理狀況對胚狀體誘導(dǎo)率發(fā)生的影響

試驗結(jié)果如表3所示，日照時間為11～12 h的供體植株小孢子胚狀體誘導(dǎo)率明顯高于日照時間為5～6 h的供體植株小孢子胚狀體誘導(dǎo)率。日照時間為11～12 h的供體植株小孢子胚狀體誘導(dǎo)率最高為紅腳黃花芥藍×612（58%），最低為香港中花芥藍（8%）；日照時間為5～6 h的供體植株小孢子胚狀體誘導(dǎo)率最高為紅腳黃花芥藍×612（12%），最低為香港中花芥藍（2%）。據(jù)統(tǒng)計，日照時間為11～12 h的供試植株的胚狀體誘導(dǎo)率是日照時間為5～6 h的3～7倍。日照時間為11～12 h的5份芥藍材料的胚狀體誘導(dǎo)率均高于日照時間為5～6 h的胚狀體誘導(dǎo)率?？梢娙照諘r間對胚狀體誘導(dǎo)率具有明顯的影響。

2.3 小孢子發(fā)育階段對小孢子胚狀體誘導(dǎo)率的影響

選取處于盛花期的植株采集花蕾，用醋酸洋紅染色法在顯微鏡下觀察小孢子的形態(tài)，判斷小孢子所處的時期。結(jié)果如圖3、圖4所示。

采用紅腳黃花芥藍×612、孤老種、黃花芥藍、綠寶和香港中花芥藍5個芥藍材料不同發(fā)育階段的小孢子分別進行游離小孢子培養(yǎng)試驗，結(jié)果如表4所示。單核靠邊期和雙核早期的胚狀體誘導(dǎo)能力強，單核靠邊期的胚狀體誘導(dǎo)率最高的是紅腳黃花芥藍×612（52%），最低的是香港中花芥藍（12%）；雙核早期的胚狀體誘導(dǎo)率最高的是紅腳黃花芥藍×612（54%），最低的是香港中花芥藍（10%）。而單核早期和雙核晚期的胚狀體誘導(dǎo)能力明顯降低，單核早期的紅腳黃花芥藍×612小孢子胚狀體誘導(dǎo)率為6%，而香港中花芥藍胚狀體誘導(dǎo)率為1%；雙核晚期紅腳黃花芥藍×612的胚狀體誘導(dǎo)率為2%，孤老種、黃花芥藍、綠寶、香港中花芥藍胚狀體誘導(dǎo)率均為0。芥藍不同發(fā)育階段的胚狀體誘導(dǎo)率差異明顯，單核靠邊期和雙核早期的胚狀體誘導(dǎo)率高，而單核早期和雙核晚期的胚狀體誘導(dǎo)率低。 結(jié)合芥藍小孢子形態(tài)及花蕾大小的相關(guān)性推測，芥藍的花蕾大小為3.0～3.5 mm時處于單核靠邊期，也屬于單核晚期；介于4.0～4.5 mm時，小孢子發(fā)育時期處于雙核期，雙核還未分開，屬于雙核早期，選擇這2個階段的花蕾作為小孢子培養(yǎng)，效果最佳。

2.4 高溫預(yù)處理對小孢子胚狀體發(fā)生的影響

比較不同溫度（25、30、32.5、35 ℃）的高溫預(yù)處理對小孢子胚狀體發(fā)生的影響。試驗結(jié)果如表5顯示，對于材料紅腳黃花芥藍×612和孤老種，32.5 ℃處理24 h時胚狀體產(chǎn)量分別為59個和30個；在30 ℃條件下培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率均明顯低于經(jīng)過熱激處理的，胚狀體產(chǎn)量分別為12個和6個，分別比在32.5 ℃處理條件下降低了79.7%和80.0%；25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)的小孢子沒有發(fā)生分化；35 ℃高溫處理的芥藍胚狀體產(chǎn)量分別為9個和4個，較32.5 ℃處理條件下降低了84.7%和86.7%。結(jié)果表明，32.5 ℃條件下處理24 h最有利于胚狀體的形成。

在32.5 ℃條件下分別處理24、48、72 h，比較不同時間下的高溫預(yù)處理對小孢子胚狀體發(fā)生的影響，試驗結(jié)果如表6所示。對于材料紅腳黃花芥藍×612和孤老種，處理24 h時胚狀體產(chǎn)量分別為56個和26個；處理48 h時胚狀體產(chǎn)量分別為11個和9個；處理72 h的小孢子沒有發(fā)生分化。結(jié)果表明，高溫預(yù)處理時間長短對胚狀體發(fā)生影響顯著，處理時間過短效果不明顯，本次試驗表明處理24 h左右最為適合。

3 討論與結(jié)論

3.1 基因型對芥藍游離小孢子培養(yǎng)的影響

不同基因型材料對芥藍游離小孢子培養(yǎng)中胚狀體的形成影響顯著，主要體現(xiàn)在胚狀體數(shù)量多少上。將40份芥藍材料在相同的條件下進行游離小孢子培養(yǎng)，只有紅腳黃花芥藍×612、孤老種、黃花芥藍、綠寶、香港中花芥藍等5份材料有胚狀體產(chǎn)生。嚴(yán)準(zhǔn)等[14]、張德雙等[22]在小孢子培養(yǎng)研究中也僅有個別基因型材料被誘導(dǎo)出胚狀體。李梅等[3]提出甘藍類蔬菜胚狀體誘導(dǎo)率是一種受基因調(diào)控的遺傳特性。說明即使在合適的條件下也并非所有基因型都適于游離小孢子培養(yǎng)，因此需要篩選出能夠通過游離小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體的芥藍。另外，基因型差異還表現(xiàn)在胚狀體誘導(dǎo)率上，紅腳黃花芥藍

×612小孢子胚狀體誘導(dǎo)率是香港中花芥藍的5.2倍。

3.2 供體生理狀況對芥藍游離小孢子培養(yǎng)的影響

供體生理狀況與小孢子胚狀體誘導(dǎo)率關(guān)系密切。通過改變供體植株的日照時間來改變供體生理狀況，日照時間為11～12 h的芥藍供體植株小孢子胚狀體發(fā)生能力明顯強于日照時間為5～6 h的供體植株小孢子胚狀體發(fā)生能力，日照時間為11～12 h的供試植株的小孢子胚狀體誘導(dǎo)率是日照時間為5～6 h的3～7倍?？梢娕郀铙w的誘導(dǎo)率與供體材料的日照長度密切相關(guān)。目前沒有關(guān)于日照時間對芥藍游離小孢子胚狀體誘導(dǎo)率影響的文獻報道，需要通過更多研究來驗證這一結(jié)果。

3.3 小孢子發(fā)育階段對芥藍游離小孢子培養(yǎng)的影響

采用不同發(fā)育階段的芥藍小孢子進行培養(yǎng)，胚狀體誘導(dǎo)率有較大差異。試驗中采用單核靠邊期及雙核早期的小孢子培養(yǎng)時胚狀體誘導(dǎo)率明顯較采用單核早期及雙核晚期小孢子培養(yǎng)時高，采用單核早期或雙核晚期的小孢子進行培養(yǎng)，胚狀體誘導(dǎo)率大大降低甚至不能產(chǎn)生胚狀體，因此在進行芥藍小孢子培養(yǎng)時應(yīng)采用單核靠邊期到雙核早期的小孢子進行培養(yǎng)。實驗結(jié)果與趙前程等[20]的研究結(jié)果一致。在顯微鏡下觀察，單核靠邊期到雙核早期的芥藍花蕾大小為3.0～4.5 mm。

3.4 高溫預(yù)處理對芥藍游離小孢子培養(yǎng)的影響

高溫預(yù)處理對小孢子胚狀體誘導(dǎo)率有顯著作用。試驗結(jié)果表明，預(yù)處理溫度過低不能產(chǎn)生胚狀體，溫度過高胚狀體誘導(dǎo)率大大降低甚至不能產(chǎn)生胚狀體，處理時間過長小孢子胚狀體誘導(dǎo)率降低或不能產(chǎn)生胚狀體。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，32.5 ℃條件下對小孢子進行高溫預(yù)處理24 h最有利于促進胚狀體發(fā)生。實驗結(jié)果與趙前程等[20]的研究結(jié)果一致。

芥藍的小孢子培養(yǎng)效率極低，多數(shù)材料誘導(dǎo)不出胚狀體或胚狀體誘導(dǎo)率極低。因此，為解決這一問題，一要加強胚狀體發(fā)生機理的研究，二要加強小孢子培養(yǎng)條件方面的研究。經(jīng)大量的試驗研究，篩選出能夠通過游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體的芥藍材料，將其應(yīng)用于新品種的選育，可大大縮短育種年限，為獲得芥藍新種質(zhì)資源開拓新的途徑。

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