鹿志偉 侯曉婉 高建明 張燕梅 楊子平 陸軍迎 李俊峰 趙艷龍 周文釗 易克賢

摘 要 以蘆筍“井崗701”胚狀體為試驗(yàn)材料，在構(gòu)建pCAMBIA3300-35S-hevein-NOS植物表達(dá)載體基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，探究菌液濃度、AS濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等4個(gè)因素對(duì)蘆筍轉(zhuǎn)基因效率的影響，以期建立高效的蘆筍轉(zhuǎn)基因體系。結(jié)果表明：用菌液濃度OD600=0.6，AS終濃度為200 μmol/L的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行侵染，侵染10 min后，暗培養(yǎng)4 d的轉(zhuǎn)基因效率最佳，經(jīng)PCR檢測(cè)，陽性轉(zhuǎn)化率達(dá)21%，獲得了轉(zhuǎn)基因幼苗。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了完整的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化體系。

關(guān)鍵詞 蘆筍；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化體系

中圖分類號(hào) S644.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Embryoids derived from asparagus“Jinggang 701”were chosen as the experimental materials. With construction of plant expression vector-pCAMBIA3300-35S-hevein-NOS， the effects of liquid bacterial concentration， AS concentration， infection time and co-culture time on asparagus transgenic efficiency were explored by the agrobacterium-mediated transgenic method. The high-efficiency transgenic system of asparagus was expected to be established in this study. The result showed that the optimal infection conditions were liquid bacterial concentration OD600=0.6， adding AS up to final concentration of 200 μmol/L， infecting for 10min and culturing under darkness for 4 d， which made the transformation rate up to 21% and got transgenic plant.

Key words Asparagus（Asparagus officinalis L.）；Agrobacterium-mediated；Genetic transformation system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.009

蘆筍（Asparagus officinalis L.）屬于天門冬屬的多年生草本植物，在歐洲、亞洲、澳大利亞以及美洲的分布尤為廣泛，中國(guó)是蘆筍的主要生產(chǎn)國(guó)之一[1]。蘆筍除了具有重要的食用價(jià)值外，還對(duì)多種疾病具有良好的治療效果，如降血糖、抗癌等，享有“蔬菜之王”的美譽(yù)[2-4]。當(dāng)前市場(chǎng)上流行的蘆筍品種雖然高產(chǎn)但是均易感病，尤其是莖枯病嚴(yán)重影響著蘆筍的產(chǎn)量，高產(chǎn)、抗病蘆筍新品種的選育已成為當(dāng)務(wù)之急。新品種選育主要有雜交育種和轉(zhuǎn)基因育種2種方式，雜交育種的隨機(jī)性、過程繁瑣、育種周期長(zhǎng)等特征致使新品種培育具有很大的不可控性，短期內(nèi)難以得到抗病高產(chǎn)的蘆筍新品種。而轉(zhuǎn)基因育種則不同，其可以對(duì)植株性狀進(jìn)行定向的改變，品種選育周期短、可控性高，日益成為品種選育的首選方式。

Hevein基因又稱為橡膠樹凝集因子基因，其表達(dá)產(chǎn)生的橡膠樹凝集因子是一個(gè)富含Cys和Gly的小分子單鏈蛋白質(zhì)，具有結(jié)合幾丁質(zhì)的作用，是乳膠中橡膠粒子凝集的主要影響因素，也是乳膠中黃色物質(zhì)的主要蛋白質(zhì)之一[5]。后來從甜菜葉片、小麥等植物種子中也發(fā)現(xiàn)了類似的hevein-like蛋白，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)hevein和hevein-like蛋白在植物體內(nèi)和體外還表現(xiàn)出廣譜的抗菌性，對(duì)細(xì)菌、真菌等病原菌都具有良好的抑菌性能[6-8]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)蘆筍轉(zhuǎn)基因育種的相關(guān)研究較少，在國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)報(bào)道，而國(guó)外僅3人對(duì)蘆筍轉(zhuǎn)基因有過報(bào)道：Hernalsteens等[9]將空的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入蘆筍莖中，并成功地在轉(zhuǎn)化植株中檢測(cè)到胭脂堿和農(nóng)桿菌素堿，證明根癌農(nóng)桿菌成功地轉(zhuǎn)入了蘆筍中。Bytebier等[10]將含有NOS-APHⅡ基因的根癌農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)入蘆筍中；Limanton-Grevet等[11]將含有uidA和nptⅡ基因農(nóng)桿菌AGL1成功轉(zhuǎn)入蘆筍胚性系中，并對(duì)后代進(jìn)行了遺傳分析。雖然研究人員已成功將外源基因轉(zhuǎn)入蘆筍植株中，但是轉(zhuǎn)化體系中轉(zhuǎn)化率均較為低下，轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)，且均無目的基因轉(zhuǎn)入。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，以蘆筍胚狀體作為外植體，在構(gòu)建含有35S-hevein-NOS表達(dá)元件的pCAMBIA3300植物表達(dá)載體基礎(chǔ)上，探究菌液濃度、AS濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等4個(gè)因素對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆筍轉(zhuǎn)基因效率的影響，以期進(jìn)一步完善農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高遺傳轉(zhuǎn)化率，并導(dǎo)入目的基因，為后期蘆筍轉(zhuǎn)基因抗病高產(chǎn)新品種選育奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物表達(dá)載體：pBI121、pCAMBIA3300，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所張樹珍實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。農(nóng)桿菌EHA105菌株和Puc57-hevein由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶均為fermentas公司產(chǎn)品，DNA聚合酶和連接酶為NEB公司產(chǎn)品，其它分析純藥品及試劑盒。蘆筍“井崗701”購(gòu)自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 外植體制備 外植體制備方法參照鹿志偉等[12]的研究方法。

1.2.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)5′TGCTCTAGAAT

GAAATACTGTACTATGTTTAT3′（添加XbaⅠ酶切位點(diǎn)）和5′CGAGCTCTCAGTTGGCACCGC3′（添加SacⅠ酶切位點(diǎn)）引物對(duì)hevein基因進(jìn)行擴(kuò)增，隨后對(duì)擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行電泳檢測(cè)。準(zhǔn)確無誤后，對(duì)擴(kuò)增得到的目的基因和pBI121進(jìn)行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切，分別使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒和膠回收試劑盒對(duì)二者進(jìn)行目的片段回收，將回收得到的目的基因和pBI121大片段進(jìn)行T4 DNA連接酶連接，獲得含hevein基因的pBI121載體（圖1）。隨后分別對(duì)改造后的pBI121載體和pCAMBIA3300進(jìn)行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，使用膠回收試劑盒對(duì)pBI121進(jìn)行小片段回收，而對(duì)pCAMBIA3300則進(jìn)行大片段回收，對(duì)得到的2個(gè)片段進(jìn)行T4 DNA連接酶連接，從而完成含有35S-hevein-NOS基因表達(dá)元件的pCAMBIA3300植物表達(dá)載體構(gòu)建（圖2），最后采用凍融法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蘆筍胚狀體對(duì)PPT的抗性實(shí)驗(yàn) 將蘆筍胚狀體切成0.6 cm2大小，添加至含0、5、10、20、40、80 mg/L PPT的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，每組實(shí)驗(yàn)添加20塊外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)20 d后，觀察蘆筍胚狀體生長(zhǎng)狀況并統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.2.4 預(yù)培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的蘆筍胚狀體切成0.6 cm2左右的小塊，置于預(yù)培養(yǎng)基上，26 ℃光培養(yǎng)2 d。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+4%蔗糖+800 mg/L谷氨酰胺+500 mg/L酸水解酪素+0.70 mg/L嘧啶醇+0.10 mg/L NAA+0.50 mg/L kinetin，pH5.8。

1.2.5 轉(zhuǎn)化菌液的制備 取-70 ℃保存含pCAMBI

A3300-35S-Hevein-NOS質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌液20 μL，置于YEP固體培養(yǎng)基（含Kanamycin 50 mg/L和Rifampicin100 mg/L）中，涂布均勻。靜置30 min，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種至含Kanamycin 50 mg/L和Rifampicin 100 mg/L 的YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)直至對(duì)數(shù)期（OD600約為0.55左右），5 500 r/min，-4 ℃離心8 min，收集菌體，液體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基懸浮。

1.2.6 侵染和共培養(yǎng) 使用液體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基將上述菌體OD600值分別調(diào)節(jié)為0.2、0.4、0.6、0.8。將預(yù)培養(yǎng)2d蘆筍胚狀體置于150 mL無菌錐形瓶中，同時(shí)錐形瓶中添加50 mL含轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌體和乙酰丁香酮（濃度分別為0、50、100、200 μmol/L）的液體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，從而對(duì)胚狀體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，侵染時(shí)間為5、10、20、40 min，26 ℃ 150 r/min振蕩。無菌濾紙擦干蘆筍胚狀體表面液體，轉(zhuǎn)移至固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，26 ℃，暗培養(yǎng)2、4、6、8 d。

1.2.7 脫菌與選擇培養(yǎng) 使用200 mg/L Timentin對(duì)共培養(yǎng)后的蘆筍胚狀體進(jìn)行脫菌10 min，100 r/min輕輕振蕩，然后無菌水清洗3次。重復(fù)3次。無菌濾紙擦干蘆筍胚狀體表面液體。最后轉(zhuǎn)移至含Timentin和PPT的固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，26 ℃，光培養(yǎng)，直至原有胚狀體表面有新的胚狀體生成，上述每組實(shí)驗(yàn)添加80塊胚狀體，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)抗性胚狀體轉(zhuǎn)化率，抗性胚狀體轉(zhuǎn)化率/%=抗性胚狀體個(gè)數(shù)/胚狀體處理總個(gè)數(shù)×100。

1.2.8 分子水平檢測(cè) PCR檢測(cè)是一種非常簡(jiǎn)單、快速和直接的轉(zhuǎn)基因苗檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)用此方法對(duì)抗性胚狀體進(jìn)行檢測(cè)。胚狀體經(jīng)PPT篩選后進(jìn)行PCR驗(yàn)證以及植株再生。采用OMEGA植物DNA提取試劑盒對(duì)抗性胚狀體進(jìn)行DNA提取，并進(jìn)行PCR檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)陽性轉(zhuǎn)化率。

1.2.9 抗性植株再生 將選擇培養(yǎng)后新長(zhǎng)出的胚狀體轉(zhuǎn)移到生苗培養(yǎng)基中，進(jìn)行苗誘導(dǎo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS19.0和Excel2007軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建

2.1.1 pBI121-Hevein載體的構(gòu)建 對(duì)pBI121-hevein植物表達(dá)載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及電泳分析，發(fā)現(xiàn)有且僅有一條約276 bp目的基因條帶，與目的基因hevein相符（圖3）。

2.1.2 植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS的構(gòu)建 對(duì)pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS植物表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切以及電泳分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)雙酶切后載體被分為2個(gè)片段，其中小片段大小為1 100 bp左右，與目的基因表達(dá)元件35S-Hevein-NOS相符（圖4）。

2.1.3 植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其驗(yàn)證 對(duì)pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS植物表達(dá)載體進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在PCR目的條帶大小為1 100 bp左右，與目的基因表達(dá)元件35S-Hevein-NOS相符（圖5）。

2.2 蘆筍胚狀體對(duì)PPT抗性的研究

由表1和圖6可以看出，隨著PPT濃度的增加，蘆筍胚狀體發(fā)生萎縮、變黃直至死亡，死亡率逐漸增加，PPT濃度為20 mg/L時(shí)胚狀體全部死亡。

2.3 不同農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化的影響

由表2可知，不同菌體濃度對(duì)抗性胚狀體的轉(zhuǎn)化率存在顯著性差異（p<0.05），當(dāng)菌體濃度為0.6時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高。由表3可知，不同侵染時(shí)間對(duì)抗性胚狀體的轉(zhuǎn)化率不存在顯著性差異（p<0.05），為達(dá)到侵染時(shí)間最短以及轉(zhuǎn)化率較高的目標(biāo)，侵染時(shí)間選擇10 min為佳。因此，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.6，侵染時(shí)間10 min時(shí)為最佳作用條件。

2.4 不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化的影響

由表4可知，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為4 d和6 d時(shí)，抗性胚狀體轉(zhuǎn)化率與其它處理相比差異顯著，轉(zhuǎn)化率分別為15.0%和14.0%。為了節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)又使轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，共培養(yǎng)時(shí)間選擇4 d為佳。

2.5 不同濃度AS對(duì)蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化的影響

由表5可知，不同AS濃度對(duì)抗性胚狀體轉(zhuǎn)化率存在顯著性差異（p<0.05）。當(dāng)AS濃度為100、200 μmoL/L時(shí)，抗性胚狀體轉(zhuǎn)化率與其它處理相比差異顯著，轉(zhuǎn)化率分別為16.0%和20.0%。為了使轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，AS添加濃度選擇200 μmoL/L作為最佳。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

由圖7可知，陽性對(duì)照和再生蘆筍植株P(guān)CR結(jié)果中目的條帶大小一致，約為1 100 bp，大小與基因表達(dá)元件35S-Hevein-NOS相符。整個(gè)轉(zhuǎn)基因過程見圖8。

3 討論與結(jié)論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受外植體類型、菌液濃度、菌株類型、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、以及乙酰丁香酮濃度等多種因素影響，而且不同植物基因型、外植體其對(duì)應(yīng)的農(nóng)桿菌最佳侵染條件不同，轉(zhuǎn)化率也具有很大差異。農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化效果最好的植物轉(zhuǎn)化方式之一，目前為止已有很多相關(guān)研究，如周月等[15]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LJAMP2基因成功導(dǎo)入“紅陽”泥猴桃中，其使用的最佳農(nóng)桿菌侵染條件為：共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.5，侵染時(shí)間為10 min，AS濃度為100 μmol/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到5.11%；Gnasekaran等[16]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘭花轉(zhuǎn)基因中，最佳的農(nóng)桿菌侵染條件為：OD600=0.8，侵染時(shí)間30 min，共培養(yǎng)4 d，AS濃度為200 μmol/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)33.6%。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究已有部分工作，如Bytebier等[17]使用愈傷組織作為外植體，經(jīng)過侵染、選擇培養(yǎng)以及植株再生等得到了轉(zhuǎn)基因蘆筍植株，但是轉(zhuǎn)化周期較長(zhǎng)。Bruno等[18]使用C58農(nóng)桿菌菌株，同時(shí)對(duì)3個(gè)基因型的蘆筍體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)得到陽性植株，但是轉(zhuǎn)化率較低，為0.6%～4%。Limanton-Grevet等[19]使用AGL1Gin農(nóng)桿菌菌株，選用5個(gè)胚性系作為侵染對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率為0.8%～12.8%，轉(zhuǎn)化率得到提高。本研究在綜合對(duì)比分析前人研究的基礎(chǔ)上，以蘆筍胚狀體作為侵染對(duì)象，采用EHA105農(nóng)桿菌菌株，并對(duì)菌體濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等侵染條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，蘆筍轉(zhuǎn)化率大大提高，最高可達(dá)21%。轉(zhuǎn)化周期得到有效地縮短，遺傳效率得到極大地提高。另外，實(shí)驗(yàn)中成功將hevein基因和bar基因轉(zhuǎn)入蘆筍植株中，有利于后期抗病、抗除草劑蘆筍新品種的選育。

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