林晗 洪陳潔 洪滔 謝安強 范海蘭 陳欣凡

摘 要 為探討內(nèi)生真菌對植株生長及養(yǎng)分含量的影響，選取8種千年桐內(nèi)生真菌菌株對千年桐幼苗接種，60 d后測定植株生長指標以及葉片和根系部分主要礦質(zhì)元素含量。結(jié)果表明，擬盤多毛孢屬和盾殼霉屬菌株對地徑和苗高增長的影響最為明顯。接種1 ∶ 2比例混合的木霉屬與毛霉菌屬菌株后，苗木生物量和根冠比的增幅顯著。盾殼霉屬、鏈格孢屬以及木霉屬菌株處理后葉片氮含量較對照增加了50%以上，根系氮含量增加了85%以上。鏈格孢屬以及木霉屬菌株有效地推動了千年桐幼苗磷含量的增長，較對照增幅超過2倍以上。盾殼霉屬和木霉屬菌株較大程度提高了幼苗的鉀含量。對比不同菌株處理對促進千年桐幼苗的葉片和根系養(yǎng)分元素含量的效果可發(fā)現(xiàn)，接種盾殼霉屬、鏈格孢屬和木霉屬菌株后，植株根系氮和磷含量的增加程度顯著高于地上部分；而鐮刀菌屬和生赤殼屬菌株對促進植株根系鉀含量的效果更為明顯。相較于單種菌株，木霉屬和毛霉菌屬菌株混合接種就促進植株養(yǎng)分吸收的效果而言并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞 內(nèi)生真菌；千年桐；主要礦質(zhì)元素；混合菌株

中圖分類號 S718.52 文獻標識碼 A

The Effect of Various Endophytic Fungi on the Growth and

Main Element Contents of Aleurites montana Seedlings

LIN Han1，2， HONG Chenjie1，2， HONG Tao1，2， XIE Anqiang1，2，

FAN Hailan1，2， CHEN Xinfan1，2， WU Chengzhen1，2，3 *

1 Forestry College of Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Key Laboratory of Fujian Universities for Forest Ecological System Process and Management， Fuzhou， Fujian 350002， China

3 Ecology and Environment College of Wuyi University， Wuyishan， Fujian 354300， China

Abstract To explore the effect of endophytic fungi on plant growth and nutrient contents， we chose 8 kinds of endophytic fungi to inoculate on Aleurites montana seedlings and determined the plant growth parameters and main element contents of leaves and roots after 60 days. The results showed that root collar diameter and height improved significantly when applied by Pestalotiopsis and Coniothyrium while biomass and root shoot ratio increased largely by the combined fungi of Trichoderma and Mucor in proportion of 1 ∶ 2. Compared with those of uninoculated seedlings， the N contents increased over 50% in leaves and over 85% in roots by the treatments of Coniothyrium， Alternaria and Trichoderma， the P contents doubled by Alternaria and Trichoderma and the K contents improved to a large extent by Coniothyrium and Trichoderma. By comparing the effects of various endophytic fungi on the nutrient contents in leaves and in roots， we found that the N and P contents in the roots increased faster than those in the leaves when treated by Coniothyrium， Alternaria and Trichoderma. Fusarium and Bionectria had obvious effects on the K contents in the roots. Compared with single endophytic fungi， the combination of Trichoderma and Mucor didn't present obvious advantages on improving plant nutrient contents.

Key words Endophytic fungi； Aleurites montana； Main element contents； Combined fungi

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.09.023

植物內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物的各組織、器官中，并且其宿主植物一般不表現(xiàn)出明顯的被感染病癥[1-2]。前人對內(nèi)生真菌感染禾草類植物的研究結(jié)果表明[3]，內(nèi)生真菌能增強宿主的競爭能力，促進宿主植株生長，提高其對生物脅迫和非生物脅迫的抗性。近年來，對木本植物-內(nèi)生真菌共生體的研究也引起越來越多關(guān)注，已有研究表明[4-6]，內(nèi)生真菌會隨著柏木（Cupressus funebris）幼苗的生長發(fā)育而生長，并對植物產(chǎn)生包括各種養(yǎng)分元素和生理狀況的影響；接種內(nèi)生真菌的桉樹（Eucalyptus spp.），其抗寒性有所增強；與馬尾松（Pinus massoniana）共生的內(nèi)生真菌能夠形成和宿主植物相同的次生代謝產(chǎn)物。

千年桐（Aleurites montana）屬大戟科（Euphor-biaceae）落葉闊葉喬木，其種子的含油率很高，可被廣泛應(yīng)用在各個領(lǐng)域，也是代替柴油的理想品種[7-8]。作為中國優(yōu)良的油料作物樹種，因其適宜溫暖和濕潤的氣候而在南方特別是福建省被大量推廣種植。并且，千年桐的凋落物歸還量較大，有利于維護林地的長期生產(chǎn)力，在閩北林區(qū)近年來開始嘗試將千年桐作為生物質(zhì)能源樹種、經(jīng)濟林樹種和生態(tài)林樹種開展多功能復(fù)合式經(jīng)營。由于用千年桐直接下種更新的方式營造和修復(fù)低效的生態(tài)林效果良好，千年桐往往栽植于土壤瘠薄的陡坡，不便對其進行人工撫育與施肥。因而提高千年桐的養(yǎng)分利用效率，維持樹體營養(yǎng)平衡對于其生長和果實收獲尤為重要。內(nèi)生真菌接種有助于將土壤中的有機養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為利于植物直接吸收利用的無機可溶性離子[9]，對促進植株生長，提高土壤養(yǎng)分的利用率，特別對N和P的吸收促進作用較為顯著。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在自然條件下，千年桐植株具有豐富的內(nèi)生真菌，但這些真菌對宿主植物的作用如何尚不清楚。本研究應(yīng)用福建農(nóng)林大學(xué)森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點實驗室篩選的8種千年桐內(nèi)生真菌菌株對千年桐幼苗接種，形成內(nèi)生真菌-千年桐共生體，在幼苗的生長過程中測定植株生長指標以及葉片和根系部分礦質(zhì)元素含量，分析內(nèi)生真菌對千年桐幼苗生長和養(yǎng)分元素的影響，并比較單一菌株與不同比例混合菌株接種的差異，擬為篩選促進千年桐養(yǎng)分利用的內(nèi)生真菌菌株提供理論基礎(chǔ)和優(yōu)良菌種信息，以此優(yōu)化千年桐的培育技術(shù)，提高其經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地概況 試驗地位于福建農(nóng)林大學(xué)福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點實驗室田間，試驗地（25°15′～26°39′N，118°08′～120°31′E）屬于典型的亞熱帶季風氣候，溫暖濕潤，雨量充沛，少霜無雪，夏長冬短，無霜期達326 d。年平均日照數(shù)為1 700～1 980 h；年均降水量為900～2 100 mm；年均溫為20～25 ℃，最冷月為1～2月，其平均氣溫達6～10 ℃；最熱月為7～8月，平均氣溫為33.7 ℃。極端高溫為42.3 ℃，極端低溫為-2.5 ℃，年相對濕度約77%。

1.1.2 菌種選擇與菌液制備 菌種來自福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點實驗室千年桐材料分離試驗獲得的8個強勢菌株（菌株已保存至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心），并將其中2種菌株進行2種不同比例混合，形成10種菌液，每種菌液3次重復(fù)（表1）。

菌液制備：將供試菌株接入50 mL的液體培養(yǎng)基，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72 h的培養(yǎng)。用無菌生理鹽水按十倍稀釋法將菌液稀釋，利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，配制成5.5×106 cfu/mL菌液[5]。

1.2 方法

1.2.1 千年桐-內(nèi)生真菌共生體的構(gòu)建 本試驗采用土培盆栽試驗，試驗所用千年桐幼苗為福建省建陽市林業(yè)局提供的千年桐1年生實生苗。選擇長勢一致的苗木于2014年5月定植于直徑15 cm，高10 cm的塑料盆中，每盆放入3 kg嚴格經(jīng)過熏蒸消毒的黃心土。經(jīng)過2個月的恢復(fù)性生長后開始對其進行接種，接種前其初始苗高、地徑分別為（32.72±3.02）cm和（5.28±0.77）cm。經(jīng)顯著性檢驗，各處理間苗高、地徑之間差異不顯著（p>0.05）。

于2014年7月4日開始連續(xù)3 d于千年桐苗木根際施入相同濃度的100 mL菌液。含對照共11個處理（表1），每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)接種10株苗木。接種60 d后測定苗木的苗高和地徑。

1.2.2 植株養(yǎng)分元素的測定 參考中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標準《森林土壤分析方法》[10]，用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定植株全碳（即有機質(zhì)）含量；采用凱氏定氮法測定植株全氮含量；采用HNO3-HClO4消煮，鉬銻抗比色法測定植株磷含量；采用原子吸收分光光度法測定植株全鉀含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)和圖表的處理，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行多重比較和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同內(nèi)生真菌對千年桐幼苗生長的影響

接菌60 d后，千年桐幼苗的地徑和苗高之間差異均達到顯著水平（p<0.05）。比較各個處理的地徑增長率可知（圖1），接種菌株ZY6后苗木地徑增長率最大，而菌株ZY4對促進地徑增長的作用最小。其中，澆施7種菌株后的千年桐幼苗地徑增長率均高于未接菌的千年桐幼苗（CK），尤其是施加ZY6、ZY5、以及ZJ2后，地徑較未接種千年桐相比增長了2倍以上。

澆施10種菌液后，千年桐幼苗的平均苗高增長率在14.07%～44.38%（圖1），均顯著高于未接菌千年桐幼苗的增長率（7.72%），其中ZJ2、ZY5、ZY3對苗高增長的影響最為明顯。

就生物量的變化而言，除了接種木霉屬菌株ZY3，鏈格孢屬菌株ZY4以及盾殼霉屬菌株ZY5后千年桐苗木生物量低于對照，其余處理后的苗木生物量均顯著高于未接菌苗木，尤其是澆施混合酶H3和擬盤多毛孢屬菌株ZJ2后，苗木生物量約為CK的2倍以上，顯著高于其他處理（圖2）。

澆施混合酶H3后，千年桐苗木的根冠比高于其他處理，擬盤多毛孢屬菌株ZJ2處理的苗木根冠比低于其他處理（圖3）。

2.2 不同內(nèi)生真菌對千年桐幼苗C和N含量的影響

由圖4-A可知，ZJ2和ZY3接種后千年桐葉片具有最高的碳含量，而ZY4的碳含量顯著小于其他處理。盡管接種5種菌株后葉片碳含量高于未接菌苗木（CK），但基本并未出現(xiàn)顯著差異（p>0.05）；而所有接種了菌株的幼苗根系碳含量都顯著小于對照組（p<0.05）。由此可見，接菌并未對千年桐幼苗的碳含量產(chǎn)生明顯促進作用。與碳含量相比，接種內(nèi)生真菌對千年桐地上地下部分的氮含量產(chǎn)生明顯影響，除了H3處理，接菌后千年桐幼苗的氮含量顯著高于對照，尤其是ZY3、ZY4和ZY5菌株處理后葉片N含量較對照增加了50%以上，根系N含量增加了85%以上（圖4-B）。各個菌株處理后千年桐苗木C/N差異不大，但基本低于對照，根系C/N與對照的差異尤為明顯，極顯著低于對照（p<0.01）（圖4-C）。

2.3 不同內(nèi)生真菌對千年桐幼苗P含量的影響

由圖5可知，ZY4處理的幼苗葉片P含量顯著高于其他菌株處理（p<0.05），ZY4、ZY3和ZY5處理的幼苗根系P含量顯著高于其他菌株處理（p<0.05）。除了ZY6葉片P含量與CK相當，所有菌株處理的地上地下P含量均高于CK，尤其是ZY4，ZY1和ZY3處理的葉片P含量是CK的2倍以上，ZY4，ZY3和ZY5處理的根系P含量是CK的3倍以上。除了ZJ2和H3，不同菌株處理的千年桐幼苗地下部分磷含量均顯著高于地上部分。由此可知，與千年桐幼苗共生的內(nèi)生真菌對植株P(guān)含量的變化具有明顯影響，對地下部分P含量增長的促進作用尤為明顯。

2.4 不同內(nèi)生真菌對千年桐幼苗K含量的影響

從圖6可以看出，除了菌株ZJ2處理以外，不同菌株處理的千年桐幼苗根系鉀含量均高于葉片。ZJ2，ZY5和ZY3菌株處理的葉片K含量最高，分別高于對照處理的32.18%， 25.71%和13.44%，ZY6，ZG2和ZY5菌株處理的根系K含量高于其他處理，均高于處理均值的10%以上。

3 討論與結(jié)論

3.1 內(nèi)生真菌對植株生長的影響

本試驗結(jié)果表明，與未接菌的植株相比，接種不同內(nèi)生真菌總體而言對于千年桐幼苗的生長和主要礦質(zhì)元素吸收具有不同程度的促進作用。對不同種植物內(nèi)生真菌的研究也得出了同樣的結(jié)論[11-12]。其主要原因可能有以下幾個方面：第一，內(nèi)生真菌可影響寄主植物地上部分和根系的酶表達，例如提高植株谷氨酰胺合成酶的活性，增加硝酸還原酶的數(shù)量，從而影響植物的氮代謝水平[12-13]。一些內(nèi)生菌與植株共生后能分泌多種胞外酶[14-15]，這些酶為提高宿主植物對養(yǎng)分的潛在利用能力創(chuàng)造條件，進而促進了植物的生長。第二，內(nèi)生真菌能夠影響植物內(nèi)源激素含量和他們之間的平衡。內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生許多促進植物生長的激素，一些如生長素、細胞分裂素等植物激素有助于促進根系生長，擴大根系吸收面積，增加根量和根系活力，從而提高植物對N、P和K等礦質(zhì)元素的吸收，也增加了養(yǎng)分的積累和遷移[16-18]。第三，共生的內(nèi)生真菌可以通過多樣化途徑以增強植株的營養(yǎng)生理。有的內(nèi)生真菌能夠在體外培養(yǎng)條件下利用銨鹽或硝酸鹽作為氮源[12]。一些內(nèi)生真菌侵入植物根皮細胞后形成菌絲結(jié)構(gòu)，皮層細胞中的真菌菌絲可被植物消解，成為養(yǎng)分攝入的一種途徑[11]。對蘭科植物的研究也證實，其根部共生的真菌通過激活植株的離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[19]，可以增強蘭科植物對養(yǎng)分的吸收利用效率。

3.2 內(nèi)生真菌對植株地上地下部分養(yǎng)分分配的影響

在葉際和根際區(qū)域，植物體時刻與眾多的有害、有益和中性微生物共同生存，并產(chǎn)生直接或間接的接觸[12]。本研究對比不同菌株處理對促進千年桐幼苗的地上地下部分養(yǎng)分元素含量的效果可發(fā)現(xiàn)：接種內(nèi)生真菌對植株根系N和P含量的增加幅度顯著高于地上部分，接種盾殼霉屬菌株、鏈格孢屬菌株和木霉屬菌株表現(xiàn)得尤為明顯。鐮刀菌屬菌株和生赤殼屬菌株促進地下部分K含量的效果顯著優(yōu)于地上部分，擬盤多毛孢屬菌株則相反。Redman等[20]對水稻的研究也發(fā)現(xiàn)，共生的內(nèi)生真菌影響了水稻體內(nèi)營養(yǎng)在地上地下部分的分配，植株優(yōu)先將養(yǎng)分分配給根部，以促進根部發(fā)育，進而提高植株對養(yǎng)分攝取的能力。但對蘭科植物的研究又發(fā)現(xiàn)[21]，接種3種內(nèi)生真菌對于大花蕙蘭地上部分N、P和K含量的增幅明顯高于地下部分。與內(nèi)生真菌共生的植株對養(yǎng)分在地上地下的分配究竟與植株本身有關(guān)，或者受定殖在根系的真菌菌絲吸收同化能力影響目前仍不可知，有待進一步分析研究。

3.3 單一菌株與混合菌株作用的比較

前人研究發(fā)現(xiàn)，很多生物化學(xué)過程的實現(xiàn)有賴于多種微生物的共同培養(yǎng)，依靠單種微生物的微弱作用難以完成整個過程[22]。同時，由于單種微生物作用的不穩(wěn)定性，2種或以上微生物的共同作用越來越引起學(xué)者們的關(guān)注。有報道指出，相較于單一菌株，多種內(nèi)生真菌的混合接種具有更好的促生作用，制造更多的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生更強的抑菌效果，甚至合成新化合物[22-24]。本試驗中將木霉屬與毛霉菌屬菌株按照不同比例混合接種，與對照相比，促進了苗木生物量和根冠比的增加，顯著提高了植株根系的N含量以及葉片和根系的P含量。但是相較于木霉屬和毛霉菌屬單種菌株的接種效果，混合接種并未表現(xiàn)明顯優(yōu)勢。不同內(nèi)生真菌之間往往產(chǎn)生直接或間接的相互作用，既可能提供彼此所需的養(yǎng)分，轉(zhuǎn)移或消除抑制產(chǎn)物，刺激相互的生理活性[25]，也可能存在競爭，或者某一菌株具有排他性。前人研究也發(fā)現(xiàn)，不同菌種及組合對不同杜鵑屬植物的促生效果不同，混合菌劑對馬纓杜鵑的效果較好，而露珠杜鵑更適于單株菌株接種[26]。本試驗中2種菌株混合對千年桐養(yǎng)分含量的促進作用弱于單一接種，這可能是由于木霉屬和毛霉菌菌株在定殖或生長過程中發(fā)生相互競爭作用，2種菌株之間的拮抗抑制了其作用的發(fā)揮。由此考慮，如果將木霉屬和毛霉菌菌株混合接種，其促進千年桐養(yǎng)分吸收的效果可能不及單一菌株處理。

參考文獻

[1] Ganley R J， Brunsfeld S J， Newcombe G. A community of unknown， endophytic fungi in western white pine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2004， 101（27）： 10 107-10 112.

[2] 臧 威， 何 旭， 孫劍秋， 等. 樺木內(nèi)生真菌的分離與代謝產(chǎn)物的抑菌活性[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報， 2012， 21（4）： 661-665.

[3] 任安芝， 高玉葆. 禾草類內(nèi)生真菌的研究進展[J].微生物學(xué)通報， 2004， 31（2）： 130-133.

[4] 何躍軍， 鐘章成， 劉濟明. 接種外生菌根真菌對柏木幼苗生長的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 36（1）： 67-69.

[5] 謝安強， 洪 偉， 吳承禎. 桉樹內(nèi)生菌對尾巨桉幼苗抗寒生理指標的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2012， 48（6）： 170-174.

[6] Deng H H， Hong T， Wu C Z， et al. Application of endophytic fungi isolated from Pinus massoniana lamb. in resin tapping[J]. Bangladesh Journal of Botany， 2015， 44（5）： 753-758.

[7] 林 晗， 陳 輝， 吳承禎， 等. 內(nèi)源激素驅(qū)動下的千年桐種源優(yōu)選[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2012， 33（11）： 1 937-1 941.

[8] 韋如萍， 薛 立. 葉面噴施稀土對千年桐幼苗生長和生理的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2005， 41（2）： 164-168.

[9] 劉 燕. 野生越橘內(nèi)生真菌的分離鑒定及對栽培種的促生作用研究[D]. 大連： 大連理工大學(xué)， 2010.

[10] 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所等. 森林土壤分析方法[M]. 北京： 中國標準出版社， 1987： 285-297.

[11] 劉 舒， 陳春黎， 劉敏等. 兩種內(nèi)生真菌對大花蕙蘭的共生效應(yīng)比較[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2016， 35（1）： 43-49.

[12] 楊 波， 陳 晏， 李 霞， 等. 植物內(nèi)生菌促進宿主氮吸收與代謝研究進展[J]. 生態(tài)學(xué)報， 2013， 33（9）： 2 656-2 664.

[13] 陳 薇， 劉 慧， 姜 楠. 不同CO2濃度和氮素處理下內(nèi)生真菌感染對高羊茅的生理生態(tài)影響[J]. 南開大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2015， 51（4）： 43-52.

[14] 袁志林， 戴傳超， 李 霞， 等. 水稻接種內(nèi)生真菌B3后生理特性的變化及對稻瘟病的抗性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005， （3）： 61-63.

[15] Upson R， Read D J， Newsham K K. Nitrogen form influences the response of Deschampsia antarctica to dark septate root endophytes[J]. Mycorrhiza， 2009， 20（1）： 1-11.

[16] Dai C C， Yuan Z L， Yang Q Y， et al. The effects of increasing production of endophytes phomopsis B3 on rice[J]. Agricultural Science and Technology， 2008， 9（1）： 39-42.

[17] Hallmann J， Sikora R A. Endophytic Fungi[A]//Biological Control of Plant Parasitic Nematodes： Building Coherence between Microbial Ecology and Molecular Mechanisms， 2011： 227-258.

[18] 牛燕芬， 李揚蘋， 羅富成， 等. 植物內(nèi)生真菌對寄主生長及抗逆性的增效機理研究進展[J]. 草原與草坪， 2015（2）： 91-96.

[19] Zhao X， Zhang J， Chen C， et al. Deep sequencing-based comparative transcriptional profiles of Cymbidium hybridum roots in response to mycorrhizal and non-mycorrhizal beneficial fungi[J]. BMC Genomics， 2014， 15： 747-769.

[20] Redman R S， Kim Y O， Woodward C J D A， et al. Increased fitness of rice plants to abiotic stress via habitat adapted symbiosis： a strategy for mitigating impacts of climate change[J]. Plos one， 2011， 6（7）： e14823.

[21] 趙楊景， 郭順星， 高薇薇， 等. 三種內(nèi)生真菌與大花蕙蘭共生對礦質(zhì)營養(yǎng)吸收的影響[J]. 園藝學(xué)報， 1999， 26（2）： 110-115.

[22] 蘇經(jīng)遷， 王國紅， 楊民和. 茶樹內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)增強對植物病原真菌的拮抗作用[J]. 菌物學(xué)報， 2010， 29（5）： 753-759.

[23] 林志偉， 浦子鋼， 孫冬梅， 等. 黃綠木霉菌等菌株混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報， 2009， 21（1）： 52-54.

[24] Strobel G A， Spang S， Kluck K， et al. Synergism among volatile organic compounds resulting in increased antibiosis in Oidium sp[J]. FEMS Microbiological Letters， 2008， 283（2）： 140-145.

[25] Holguin G， Bashan Y. Nitrogen-fixation by Azospirillum brasilense Cd is promoted when co-cultured with a mangrove rhizosphere bacterium（Staphylococcus sp.）[J]. Soil Biology and Biochemistry， 1996， 28（12）： 1 651-1 660.

[26] 宋慧娟， 趙富群， 洪文君， 等. 杜鵑花屬植物內(nèi)生真菌對毛棉杜鵑幼苗生長的影響[J]. 廣東林業(yè)科技， 2015， 31（4）： 47-51.