趙秋芳 董晨 決登偉 陳宏良

摘 要 泛素結(jié)合酶（E2s）促進底物泛素化或者與E3s鏈接，是靶蛋白泛素化的關(guān)鍵酶，在泛素-蛋白酶體途徑中起重要作用。利用可可（Theobroma cacao L.）全基因組測序數(shù)據(jù)，共鑒定出45個E2s基因家族成員，包括39個UBC和6個UEV基因。通過生物信息學方法，對可可E2s家族的基本理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)預測、亞細胞定位、進化關(guān)系等方面進行初步分析。結(jié)果表明：可可E2s基因CDS長度在441（TcUEV3）～3 651 bp（TcUBC7）之間，對應的編碼蛋白氨基酸數(shù)目在146（TcUEV3）～1 216 aa（TcUBC7）之間，編碼蛋白分子量在16.39～134.71 ku之間。E2s基因外顯子在1～11之間，多數(shù)基因外顯子數(shù)目在5～7之間。E2s基因在10條染色體上均有分布，1號染色體為7個，數(shù)量最多；6號染色體2個基因，數(shù)量最少?？煽蒃2s蛋白大多為不穩(wěn)定蛋白，且均為親水性蛋白，其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件。大多數(shù)可可E2s蛋白定位在細胞核，少數(shù)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細胞質(zhì)。進化樹分析表明：可可E2s蛋白被分為20個亞家族，包括 16個UBC亞家族和4個UEV亞家族，第Ⅵ亞家族E2s數(shù)目最多為9個；E2s家族蛋白在物種進化過程中具有高度保守性。

關(guān)鍵詞 可可；泛素結(jié)合酶（E2s）；基因家族；生物信息學

中圖分類號 S571.3 文獻標識碼 A

細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和降解必須保持平衡，才能維持細胞的穩(wěn)態(tài)和正常功能。泛素-蛋白酶體途徑（Ubiqutin-proteasome pathway， UPP）是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，廣泛參與植物生長發(fā)育相關(guān)過程，尤其在維持細胞功能、細胞衰老、胚胎發(fā)育、光形態(tài)建成、組織分化、晝夜節(jié)律控制、花器官發(fā)育、激素信號響應、抵御生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[1-9]。泛素化過程主要由泛素活化酶（ubiquitin-activating enzymes， E1s）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzymes， E2s）和泛素連接酶（ubiquitin-protein ligases， E3s）3種主要的酶來完成[10]。其中E2s是蛋白泛素化的中間環(huán)節(jié)，在泛素化系統(tǒng)中，負責將E1s激活的泛素分子轉(zhuǎn)移至底物或者E3s，調(diào)節(jié)目標蛋白聚泛素鏈的形成，并與E3s共同確定底物的特異性[11-13]。

E2s蛋白在真核生物中廣泛存在，所有E2s蛋白均包含由150左右的氨基酸組成保守催化結(jié)構(gòu)域，稱為UBC domain，內(nèi)含有1個高度保守的半胱氨酸活性位點[14-15]。另外還存在一類UEV（ubiqutin E2 variants）蛋白[16]，該蛋白家族在序列和結(jié)構(gòu)上與E2s相似，但是缺少半胱氨酸催化位點，其功能也與典型的E2s蛋白有所不同[17-18]。隨著全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，基于E2s蛋白所具有的高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域，E2s家族已在多個真核生物中被鑒定出來，如酵母[15]、線蟲[19]、人類[20]、擬南芥[21]、水稻[13]、番茄[22]、香蕉[23]、玉米[24]等。但目前對E2s蛋白家族的功能研究仍然偏少，僅在擬南芥上有較為深入的研究。如研究表明擬南AtUBC1和AtUBC2參與葉片發(fā)育和植物成花抑制基因的激活，atubc1-1 atubc2-1的雙突變體表現(xiàn)出擬南芥蓮座葉減少和花期明顯提前的突變表型[5]；AtUBC13在DNA復制后修復以及N-末端序列的蛋白降解方面發(fā)揮著重要作用[25]；另外COP10作為擬南芥的UEV蛋白，其在植物的光形態(tài)建成中起著重要作用[26]。

可可（Theobroma cacao L.）與咖啡、茶一同被稱為世界三大飲料作物，原產(chǎn)于亞馬遜河上游熱帶雨林，主要分布在南北緯10°以內(nèi)地帶。可可的營養(yǎng)豐富，滋味醇香，具有興奮與滋補作用，主要被用來制作飲料、巧克力、糕點等高檔食品，具有較高的經(jīng)濟價值[27-28]。目前，世界上有超過50個國家進行規(guī)模種植[29]。隨著可可全基因組的測序成功，更多的可可基因資源可供挖掘利用，也為鑒定可可E2s基因提供數(shù)據(jù)支持。本研究從可可全基因組數(shù)據(jù)庫中分析篩選E2s家族基因，并利用生物信息學的方法，對篩選到的E2s家族進行理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、二級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位預測、系統(tǒng)進化等方面進行初步分析，以期為后續(xù)開展可可E2s家族基因相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以熱帶特色作物可可（Theobroma cacao L.）為研究對象，基因數(shù)據(jù)來源于Cacao Genome Database數(shù)據(jù)庫（http：//www.cacaogenomedb.org/）及Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥、水稻和可可E2s家族基因序列的獲取

根據(jù)文獻報道，在TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/）和水稻RAP 數(shù)據(jù)庫（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）中分別提取48個擬南芥[19]和48個水稻[20]E2s基因的CDS序列和蛋白序列，以FASTA格式保存。用擬南芥的E2s蛋白序列在Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中，通過基因查找和序列比對，查找可可基因組中所有E2s基因的CDS和蛋白序列，并利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線分析軟件對候選基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域進行鑒定，凡是含有UBC保守結(jié)構(gòu)域的蛋白即為E2s家族成員。

1.2.2 可可E2s基因結(jié)構(gòu)分析 利用Gene Structure Display Server GSDS在線軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對可可的E2s基因結(jié)構(gòu)進行作圖，可可編碼區(qū)序列（CDS）與基因組DNA序列來自Phytozome（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）基因組數(shù)據(jù)庫。

1.2.3 可可E2s蛋白的氨基酸序列屬性分析 將獲得的可可E2s蛋白的氨基酸序列投入Ex-PAsy （http：//www.expasy.org/）站點，利用其中的Prot-Param軟件在線分析E2s蛋白的分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等物理屬性。二級結(jié)構(gòu)分析采用在線SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html），所有參數(shù)均為默認值。亞細胞定位采用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）進行分析。

1.2.4 可可和擬南芥、水稻E2s家族蛋白系統(tǒng)進化分析 利用Clustal W對可可、擬南芥和水稻中所有E2s蛋白序列進行序列比對，結(jié)合MEGA6.06軟件構(gòu)建可可、擬南芥及水稻E2s蛋白家族的無根進化樹，進化樹生成采用鄰接法（neighbor joining，NJ），參數(shù)設置：使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構(gòu)建，選擇了成對刪除（pairwise deletion）空位（gap）的選項，Bootstrap method取值1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 可可E2s家族基因鑒定和基因相關(guān)信息分析

E2s蛋白均包含高度保守的催化結(jié)構(gòu)域（UBC domain），根據(jù)其UBC結(jié)構(gòu)域，通過基因查找和序列比對，最終確定45個可可E2s基因，其中包含39個UBC和6個UEV基因，為了描述方便，將篩選到的E2s基因根據(jù)其在染色體上的位置，分別命名為TcUBC1-39和TcUEV1-6（見表1）。由表1可以看出，可可E2s家族基因序列在轉(zhuǎn)錄后會產(chǎn)生1～5個可變剪接，其中TcUBC7和TcUBC23的可變剪接數(shù)為5個，數(shù)量最多。可變剪接被認為是導致蛋白質(zhì)功能多樣性的重要原因之一，使一個基因可編碼多個不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白產(chǎn)物，已有研究表明，可變剪接在產(chǎn)生受體多樣性、調(diào)節(jié)生長發(fā)育等方面起決定性作用[30]。鑒于較多的可可E2s基因存在可變剪接，在分析基因結(jié)構(gòu)特征時，僅選擇最主要的可變剪接體進行分析（詳見Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫的注釋）。已鑒定到的可可E2s基因CDS長度在441（TcUEV3）～3 651 bp（TcUBC7）之間，跨度較大，對應的編碼蛋白氨基酸數(shù)目在146（TcUEV3）～1 216 aa（TcUBC7）之間，編碼蛋白分子量在16.39～134.71 ku之間。蛋白質(zhì)等電點分析結(jié)果表明可可E2s蛋白包含酸性、中性、堿性3種蛋白，其中等電點小于6.5的蛋白有19個，顯酸性；6.5～7.5之間的蛋白有4個，顯中性；大于7.5的蛋白個數(shù)有23個，顯堿性。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)可可E2s蛋白大多數(shù)屬于不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)>40；TcUBC7/10/19/20/21/24/30和TcUEV2/3/4/5共10個E2s蛋白為穩(wěn)定蛋白。疏水性分析顯示平均疏水性（GRAVY）在-0.894（TcUBC33）～-0.07（TcUEV5）之間，表明所有可可E2s蛋白均為親水性蛋白?？煽蒃2s蛋白脂肪系數(shù)（AI）在62.78（TcUBC6）～91.49（TcUBC14）之間（表1）。

可可E2s家族基因在10個染色體上均有分布，但分布并不均勻（圖1）。1號染色體數(shù)量最多為7個；2號、3號和9號染色體上有6個基因；8號染色體有5個基因；10號染色體有4個；4、5和7號染色體均分布有3個E2s基因；6號染色體分布有2個基因，數(shù)量最少?？煽蒃2s基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示：E2s基因含1個（TcUBC20、TcUEV6）至11（TcUBC23）個外顯子，而多數(shù)基因的外顯子數(shù)目在5～7之間（表1和圖2）。

2.2 可可E2s蛋白的二級螺旋結(jié)構(gòu)、亞細胞定位預測及UBC結(jié)構(gòu)域分析

可可E2s蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測結(jié)果如表2所示?？煽蒃2s蛋白均由α-螺旋、擴展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種形式組成，以無規(guī)則卷曲為主的蛋白有24個，所占百分比在33.3%～47.66%之間，以α-螺旋為主要構(gòu)成元件蛋白有19個，所占百分比在33.72%～53.09%之間，另外TcUBC15和TcUBC17α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占百分比一致，均為40.54%?？煽蒃2s蛋白擴展鏈結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角所占百分比例較小，說明可可E2s蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

蛋白質(zhì)亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)可可E2s蛋白大多定位于細胞核中，少數(shù)蛋白被定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細胞質(zhì)中，如TcUBC11、TcUBC13、TcUBC22和TcUBC27定位在細胞質(zhì)和細胞核中，TcUBC36定位在細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而TcUBC18和TcUBC38僅定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

盡管E2s蛋白均含有一個由150個氨基酸組成的高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域，但是N端和C端的大小和結(jié)構(gòu)上仍然存在很大差別，而這些側(cè)翼序列參與底物的選擇，二聚反應和其他相關(guān)過程，往往導致E2s蛋白間的功能差異[31-32]。根據(jù)是否具有N端和C端延長鏈，將E2s蛋白分為4大亞類，ClassⅠ僅含有UBC/UEV結(jié)構(gòu)域，ClassⅡ包含UBC/UEV結(jié)構(gòu)域和C端延長的蛋白序列，ClassⅢ包含UBC/UEV結(jié)構(gòu)域和N端延長的蛋白序列，ClassⅣ包含UBC/UEV結(jié)構(gòu)域、N端和C端延長的蛋白序列[33]。通過SMART程序分析可可E2s蛋白的UBC結(jié)構(gòu)域（圖3）?？煽蒃2s蛋白UBC結(jié)構(gòu)存在4大亞類，其中屬于ClassⅣ亞類的E2s蛋白為16個，數(shù)量最多，其氨基酸數(shù)目在159～1 216 aa之間（表1）；其次為ClassⅠ亞類，為14個，氨基酸數(shù)目在148～166 aa之間（表1），ClassⅡ和ClassⅢ亞類分別包含9個和6個E2s蛋白，氨基酸數(shù)目分別在161～276 aa和172～517 aa之間（表1）。ClassⅠ亞類僅含有UBC結(jié)構(gòu)，因此其氨基酸數(shù)目相對較少；ClassⅢ亞類僅包含C端延長和UBC結(jié)構(gòu)域，而TcUBC34（517 aa）長于ClassⅣ亞類中除了TcUBC7（1 216 aa）和TcUBC26（661 aa）之外的所有蛋白，E2s蛋白結(jié)構(gòu)域之間的差異也導致其功能間的差異。

2.3 可可E2s蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

為了分析可可E2s家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用可可45個E2s蛋白，模式植物擬南芥48個E2s蛋白[21]和水稻48個E2s蛋白[13]（均包括其UEV蛋白）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），并參照擬南芥E2s蛋白亞家族分類[21]。進化分析將45個可可E2s蛋白分為20個亞家族，包括16個UBC亞家族和4個UEV亞家族。各亞家族所含E2s蛋白數(shù)量差異較大，其中Ⅵ亞家族包含可可E2s蛋白為9個，數(shù)量最多，分別是TcUBC1/5/8/15/17/25/31/32/37；其次為Ⅺ家族，包含6個E2s蛋白，分別為TcUBC7/10/19/20/24/26。而Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ、ⅩⅢ、ⅩⅤ、ⅩⅥ共6個亞家族中，僅包含一個E2s蛋白，分別為TcUBC33、TcUBC21、TcUBC14、TcUBC30、TcUBC27、TcUBC34。另外，Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅣ共5個亞家族均含有2個E2s蛋白。TcUBC4和TcUBC28屬于Ⅰ亞家族，TcUBC3和TcUBC9屬于Ⅱ亞家族，TcUBC36和TcUBC38屬于Ⅴ亞家族，TcUBC35和TcUBC39屬于Ⅷ亞家族，TcUBC18和TcUBC23屬于ⅩⅣ亞家族。TcUBC11/12/13屬于Ⅲ亞家族。6個UEV蛋白被分為ⅩⅦ、ⅩⅧ、ⅩⅨ和ⅩⅩ四個亞家族，其中TcUEV1和TcUEV6屬于ⅩⅦ亞家族；TcUEV2和TcUEV3屬于ⅩⅧ亞家族；TcUEV4和TcUEV5分別屬于ⅩⅨ和ⅩⅩ亞家族。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可以用來識別不同物種間直系同源基因和物種內(nèi)旁系同源基因，通常直系同源基因的發(fā)生會促使新物種的形成，而旁系同源基因產(chǎn)生則是新功能的來源[34]。進化樹分析鑒定出6對旁系同源蛋白，分別為TcUBC2和TcUBC29、TcUBC3和TcUBC9、TcUBC4和TcUBC28、TcUBC35和TcUBC39、TcUEV2和TcUEV3、TcUEV1和TcUEV6?？煽蒃2s蛋白與擬南芥和水稻均存在直系同源蛋白，校驗參數(shù)（bootshap）>90%的分別有10對和8對，其中TcUBC14、TcUBC18、TcUBC23、TcUBC33、TcUEV4在擬南芥和水稻中均存在其直系同源蛋白。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著基因組測序技術(shù)的不斷提高，越來越多的植物完成全基因組的測序工作，這也促使相關(guān)基因家族研究快速發(fā)展。E2s家族在植物生長發(fā)育方面起著非常重要的作用，而目前僅在擬南芥[21]、水稻[13]、番茄[22]、玉米[24]等模式植物中有部分研究，許多作物仍然亟待開展E2s基因家族的相關(guān)研究。本研究通過對可可全基因組全面查找、各種軟件和在線工具分析，共鑒定出45個E2s基因，其中包括39個UBC基因和6個UEV基因，其E2s基因數(shù)目與水稻（48）和擬南芥（48）相似。E2s基因家族在生物演變過程中不斷擴大，低級真核生物的E2s基因數(shù)目少于高級真核生物[20]。已有報道低級真核生物酵母中發(fā)現(xiàn)13個[15]，線蟲中20個[19]，綠藻中19個（數(shù)據(jù)未發(fā)表）；而在高級植物和動物中E2s基因數(shù)目較多，比如在人類中發(fā)現(xiàn)37個[20]，番茄中52個[22]，香蕉中74個[23]，玉米中75個，其中69個UBC基因和6個UEV基因[24]。

為了揭示可可E2s家族的進化關(guān)系，將擬南芥、水稻和可可共141個E2s蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進化分析將可可E2s蛋白分為20個亞家族，各亞家族所含蛋白數(shù)目差別很大，Ⅵ亞家族包含9個E2s蛋白，Ⅺ亞家族為6個。擬南芥和水稻的Ⅵ和Ⅺ亞家族也包含較多的E2s蛋白，但在數(shù)目上有差別，如二者Ⅵ亞家族均包含8個E2s蛋白，而Ⅺ亞家族中包含4個和9個E2s蛋白。可可在亞家族Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ、ⅩⅢ、ⅩⅤ、ⅩⅥ僅有1個E2s蛋白，擬南芥[21]和水稻[35]這些亞家族也包含較少E2s蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的亞家族包含擬南芥、水稻和可可3個物種，而少數(shù)亞家族僅包括1個或2個物種。如ⅩⅢ和ⅩⅦ亞家族包括擬南芥和可可2個物種；而ⅩⅩ亞家族僅包含可可E2s蛋白（TcUEV5），這表明該蛋白可能是生物進化過程中可可所特有的E2s蛋白。以往研究發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥E2s蛋白亞家族非常相似，揭示在單子葉和雙子葉植物分化之前E2s家族已經(jīng)存在。本研究發(fā)現(xiàn)可可與擬南芥和水稻間均存在直系同源蛋白，也進一步證明植物E2s蛋白具有共同的起源，進化過程高度保守。另外，同一亞家族E2s在基因結(jié)構(gòu)和UBC結(jié)構(gòu)域上往往具有較高的相似性[24]。在可可Ⅵ亞家族中TcUBC8/15/25/31/32均含有5個外顯子，基因結(jié)構(gòu)相似；且TcUBC1/5/8/15/17/25/31/37UBC結(jié)構(gòu)域也相似，均屬于ClassⅠ亞類。同一亞家族的E2s蛋白在功能上往往也較為相似，進化分析表明TcUEV4和AtCOP10之間校驗參數(shù)（bootshap）達98%，因此根據(jù)前人研究可以推測TcUEV4可能對可可的光形態(tài)建成起著重要作用，但其具體功能仍需后續(xù)驗證。

可可屬于典型的熱帶作物，適宜在高溫、高濕且較為蔭蔽的環(huán)境下種植，但我國熱區(qū)面積有限，適宜可可種植區(qū)域較少，且在生產(chǎn)上容易遭受低溫和干旱等逆境脅迫，影響可可產(chǎn)業(yè)發(fā)展。泛素結(jié)合酶作為泛素化途徑中的關(guān)鍵酶，在調(diào)控植物生長、發(fā)育和響應逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。而目前，可可E2s家族基因相關(guān)研究仍未見報道。本研究對可可E2s基因家族進行了初步分析，為將來深入研究該基因家族的表達調(diào)控、結(jié)構(gòu)和功能等提供參考，也為進一步揭示該基因家族參與可可生長、發(fā)育的調(diào)控以及響應逆境脅迫的機制提供理論依據(jù)。

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