陳振東 鄭濤 林秀香 林藝華 鄭少緣 蘇金強(qiáng)

摘 要 采用ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)9個(gè)種44份野牡丹屬種質(zhì)資源進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明：11條ISSR引物共擴(kuò)增出91條譜帶，其中多態(tài)性條帶90條，多態(tài)性條帶的比率為98.9%；16 條RAPD引物共擴(kuò)增出113條譜帶，其中101條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為89.38%。2種分子標(biāo)記相比較，ISSR分子標(biāo)記檢測出的多態(tài)性比率更高。44份野牡丹屬種質(zhì)明顯聚為2組，種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)在0.61～0.88，平均相似系數(shù)0.75?；诓煌锏臈l帶組合構(gòu)建了供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的ISSR和RAPD指紋圖譜，采用這2種指紋圖譜可對(duì)供試的所有野牡丹屬種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定。

關(guān)鍵詞 野牡丹屬；種質(zhì)；分子標(biāo)記；親緣關(guān)系；指紋圖譜

中圖分類號(hào) S682.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

野牡丹科（Melastomaceae）植物全世界約240個(gè)屬，共3 000余種[1]。野牡丹屬（Melastoma）屬于野牡丹科，大約有100個(gè)種，分布中心處于東南亞一帶，中國有9個(gè)種和1個(gè)變種，主要分布帶處于長江以南各個(gè)省區(qū)[2]。野牡丹屬植物花色有白色系、粉色系、紫色系，其花期長、花量大，株型從地被、灌木到小喬木均有分布，園林運(yùn)用上可做到周年有花（花期：地菍、印度白花野牡丹四季開花，展毛野牡丹3～4月，紫毛、多花、細(xì)葉野牡丹、毛菍5～6月份，野牡丹、毛菍7～8月），具備良好的觀賞性狀；此外，該屬植物的藥用價(jià)值近來也有深入研究[3-4]，發(fā)展前景廣泛。目前，絕大多數(shù)的野牡丹屬植物仍未被人工開發(fā)利用，已在野牡丹屬種質(zhì)資源的收集及評(píng)價(jià)[5-9]、栽培技術(shù)[10]、脫毒育苗[11-13]、傳粉特性[14-15]以及種子發(fā)育[16]等方面進(jìn)行了研究。

目前，針對(duì)野牡丹屬的分類研究主要集中于宏觀形態(tài)學(xué)[16]、細(xì)胞遺傳學(xué)[17]、孢粉學(xué)[18]、細(xì)胞學(xué)[19]、表型多樣性[20-21]等方面，利用分子標(biāo)記對(duì)野牡丹種質(zhì)資源的遺傳性進(jìn)行研究還比較少。鄭濤等[22]利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)福建省33份野牡丹屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究，聚類分析表明，34份材料可劃分為3個(gè)類群5個(gè)亞類，主坐標(biāo)散點(diǎn)分析可分為4個(gè)類群，這與根據(jù)形態(tài)學(xué)劃分的結(jié)果基本一致。野牡丹屬因?yàn)榉植挤秶鷱V、自然雜交類型豐富，一些野生種質(zhì)的分類尚未十分明確，給人工雜交親本選擇帶來了不少困擾。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上擴(kuò)大了取樣范圍，以中國的44份野牡丹屬種質(zhì)為研究對(duì)象， 利用ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，再次從分子水平上探討野牡丹屬內(nèi)的親緣關(guān)系，為有效利用分子標(biāo)記評(píng)價(jià)野牡丹屬種質(zhì)資源遺傳多樣性及遺傳基礎(chǔ)提供理論依據(jù)，同時(shí)，利用篩選出的通用引物構(gòu)建44份野牡丹屬野生種質(zhì)資源的RAPD、ISSR指紋圖譜，為野牡丹屬野生種質(zhì)資源快速鑒定及后期人工選育種親本選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試材料為野牡丹屬野生種質(zhì)資源共9個(gè)種44份材料，來源于福建、廣東、廣西、海南、云南5個(gè)省份。采集新鮮葉片凍于液氮，保存在-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用前期試驗(yàn)確定的改良CTAB法提取野牡丹基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度法定量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立：DNA模板（30 ng/μL）0.7 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.6 μL，引物（10 μmol/L）0.8 μL，Taq酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O定容20 μL。反應(yīng)程序：反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；53 ℃退火40 s；72 ℃延伸2 min。

PAPD-PCR反應(yīng)體系的建立：DNA模板（20 ng/uL）1.5 μL，10×Taq Green Buffer（含Mg2+）2 μL，引物（10 μmol/L）0.7 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O定容20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，38 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 引物篩選 從116條ISSR、100條RAPD隨機(jī)引物中分別篩選出11條、16條多態(tài)性好、條帶清晰的引物供PCR反應(yīng)（表2、表3）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)2種分子標(biāo)記方法通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的條帶圖片，對(duì)同一引物所擴(kuò)增出遷移率相同的條帶計(jì)為1個(gè)位點(diǎn)，有條帶的位置計(jì)為“1”，無條帶位置計(jì)為“0”，所得數(shù)據(jù)輸入Excel 2003工作表建成原始“0/1”數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS聚類分析軟件進(jìn)行聚類分析。針對(duì)所有供試品種，對(duì)11條ISSR引物和16條RAPD引物擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行比對(duì)，選出鑒別能力較強(qiáng)的引物，然后對(duì)由這些引物經(jīng)PCR反應(yīng)跑出的電泳條帶進(jìn)行形象化處理，同一位點(diǎn)上記為“1”的電泳條帶用黑色方塊表示，記為“0”的條帶用白色方塊表示，據(jù)此構(gòu)建出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR分子標(biāo)記結(jié)果與分析

本研究以前期試驗(yàn)篩選出的11條ISSR隨機(jī)引物對(duì)供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源進(jìn)行DNA多態(tài)性檢測[16]，總共擴(kuò)增出91條清晰度好，重復(fù)性高的譜帶，其中多態(tài)性譜帶有90 條，多態(tài)性條帶比例為98.9%（表2）。擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物為UBC857 、UBC811和CW32506，位點(diǎn)數(shù)均為12個(gè)。其中引物UBC857對(duì)44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴(kuò)增圖譜見圖1。

2.2 RAPD標(biāo)記結(jié)果與分析

16條RAPD引物共擴(kuò)增出113條譜帶，其中101條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為89.38%。擴(kuò)增產(chǎn)物大小集中在2 00～2 000 bp。擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物是S1、S19、S43，位點(diǎn)數(shù)均為9。其中引物S19對(duì)44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴(kuò)增圖譜見圖2。

2.3 44份野牡丹屬種質(zhì)親緣關(guān)系分析

綜合44份野牡丹屬種質(zhì)ISSR和RAPD擴(kuò)增條帶數(shù)做聚類分析，聚類結(jié)果見圖3?？蓪⒐┰囈澳档俜N質(zhì)資源分為2大類群。3號(hào)毛菍與其他各地的地菍聚為Ⅰ類；其他36份野牡丹屬種質(zhì)聚類Ⅱ類。Ⅱ類野牡丹屬種質(zhì)較多，可細(xì)分為3組，1組為1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、10號(hào)、9號(hào)、12號(hào)、11號(hào)、18號(hào)、13號(hào)、19號(hào)、21號(hào)、20號(hào)、33號(hào)；2組為30號(hào)、31號(hào)、32號(hào)、34號(hào)、35號(hào)、36號(hào)、37號(hào)、38號(hào)、39號(hào)、40號(hào)、41號(hào)、43號(hào)、44號(hào)、；3組為14號(hào)、27號(hào)、28號(hào)、29號(hào)福建多花野牡丹與42號(hào)云南普洱的多花野牡丹。44份野牡丹屬種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)在0.61～0.88，平均相似系數(shù)為0.75，表明44份野牡丹屬種質(zhì)之間的親緣關(guān)系較近。

2.4 44份野牡丹屬種質(zhì)指紋圖譜的建立

由于ISSR引物的多態(tài)性，同一引物擴(kuò)增出的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的條帶有明顯差異。比對(duì)結(jié)果表明：利用引物UBC811可以鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851可以鑒別出42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可以鑒別出供試的44份野牡丹種質(zhì)資源。

從篩選16條ARAPD引物中選擇多態(tài)性好、鑒別效率高的核心引物S19和S43，建立44份野牡丹屬種質(zhì)資源的指紋圖譜（圖5）。利用引物S19可以鑒別出30份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物S43可以鑒別出29份野牡丹種質(zhì)資源，而采用引物S19和S43組合可以鑒別出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源。由圖5可知，利用2條RAPD核心引物可建立44份野牡丹種質(zhì)資源的指紋圖譜，每個(gè)品種都有唯一的指紋圖譜。

3 討論與結(jié)論

3.1 分子標(biāo)記用于野牡丹種質(zhì)的遺傳變異研究

采用ISSR分子標(biāo)記研究44份野牡丹種質(zhì)的遺傳變異情況，10條ISSR引物共擴(kuò)增出91條帶，其中多態(tài)性條帶90條，多態(tài)性比率98.9%；采用RAPD分子標(biāo)記對(duì)44份野牡丹種質(zhì)的遺傳變異進(jìn)行研究，16條PAPD引物共擴(kuò)增出113條帶，其中多態(tài)性條帶101條，多態(tài)性比率89.38%?？梢?，2種分子標(biāo)記均可檢測出野牡丹種質(zhì)資源間較為豐富的遺傳變異；但比較起來，ISSR分子標(biāo)記檢測出的多態(tài)性比率比RAPD分子標(biāo)記檢測出的高。采用ISSR分子標(biāo)記研究野牡丹屬種質(zhì)間的遺傳變異，其多態(tài)性位點(diǎn)的百分率為98.9%，高于新疆紅花（Canluumts tinctorius）[21]品種間的93.77%、菊花（Dendranthema×grandi flora）[22]品種間的92.5%和君子蘭[23]（Clivia）品種間的81.95%；采用RAPD標(biāo)記研究野牡丹種質(zhì)的遺傳變異，其多態(tài)性位點(diǎn)的百分率僅為89.38%，接近于亞麻（Linum usitatissimum）[24]品種間的90.49%，高于石蒜（Lycoris Herb.）[25]品種間的70%，低于紅花（Canluumts tinctorius）[21]品種間92.31%。2種分子標(biāo)記遺傳相似性分析結(jié)果表明，野牡丹屬種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)0.61～0.88之間，表明44份野牡丹屬種質(zhì)資源之間親緣關(guān)系較近。

3.2 野牡丹屬種質(zhì)的遺傳變異分析

與之前的研究結(jié)果[22]對(duì)比，本研究擴(kuò)大了取樣范圍，從外觀形態(tài)上判斷，增加了《福建植物志》以外的3個(gè)種（紫毛、印度、大野牡丹）進(jìn)行比較分析，得到較為全面的分析數(shù)據(jù)。本研究2種分子標(biāo)記方法都將地菍單獨(dú)聚為一類，這與先前的研究結(jié)果[22]相同，表明地菍與其它種間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，在自然雜交過程中的參與度較低；4號(hào)印度白花野牡丹是印度野牡丹（Melastoma malabathricum，粉色花）的變異種，研究結(jié)果將其與5號(hào)廣州多花野牡丹聚在一起，說明二者在親緣關(guān)系上非常接近。研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，通過形態(tài)學(xué)觀測很難準(zhǔn)確的將野牡丹屬中的幾個(gè)種進(jìn)行區(qū)分，甚至發(fā)生錯(cuò)誤分類，例如，44號(hào)大野牡丹葉片、花瓣顯著大于其他樣品，形態(tài)特征與大野牡丹類似，通過形態(tài)學(xué)分類很容易將其歸為大野牡丹類，而標(biāo)記結(jié)果則表明其應(yīng)為多花野牡丹類群；32號(hào)云南版納的多花野牡丹應(yīng)為野牡丹類群；37號(hào)云南版納的野牡丹，與38、39親緣關(guān)系最近，兼有野牡丹、展毛野牡丹的特征，因此將其歸為展毛野牡丹更為準(zhǔn)確。另外，野牡丹屬親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不但與種的類別有關(guān)也與地域分布存在一定關(guān)系，相同來源地的野牡丹屬植物因種間差異可能親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，如10號(hào)與12、/13號(hào)，而不同來源地的植物因種間差異較小可能被聚為一類，如30、/31號(hào)，這也說明多花野牡丹種內(nèi)存在比較明顯的基因分離現(xiàn)象，遺傳背景比較復(fù)雜。從本研究的樣品分析來看，地菍具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性，其余野牡丹屬種間、不同來源地的同種植物存在明顯的基因交叉，再次證明了前期研究得到的野牡丹屬植物“遺傳背景復(fù)雜、自然雜交類型豐富、親緣關(guān)系總體較近”的結(jié)論。

本研究分別篩選出2條特異引物建了供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的ISSR和RAPD指紋圖譜，采用這2種指紋圖譜可對(duì)供試的所有野牡丹屬種質(zhì)行鑒定，為利用分子標(biāo)記技術(shù)快速、準(zhǔn)確地鑒定野牡丹屬資源奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳 介. 中國植物志， 第53卷第1分冊(cè)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1984： 137-190.

[2] 胡松梅， 蔣道松， 龔澤修. 野牡丹屬植物研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代園藝， 2007（5）： 3-6.

[3] 梁春玲， 周玖瑤， 吳俊標(biāo)， 等. 野牡丹抗炎鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)小白鼠免疫功能影響的研究[J]. 中國藥師， 2012， 15（11）： 34-36.

[4] 劉 惠， 沈毅華， 劉 文. 野牡丹提取物對(duì)血小板聚集的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 30（5）： 12-15.

[5] 彭東輝， 張啟翔， 黃俊婷. 中國野牡丹科觀賞植物種質(zhì)資源及其在福建省的分布初步調(diào)查[J]. 中國園林， 2008， 23（11）： 83-88.

[6] 林秀香， 蘇金強(qiáng)， 黃阿鳳. 福建野牡丹科植物資源初步調(diào)查及評(píng)價(jià)[J]. 福建熱作科技， 2003， 28（4）： 17-19.

[7] 馬國華， 林有潤. 華南野牡丹科野生花卉種質(zhì)資源的收集和繁殖[J]. 中國野生植物資源， 2001， 20（6）： 72-73.

[8] 范建紅， 馮志堅(jiān). 廣東野牡丹科野生觀賞植物資源[J]. 中國野生植物資源， 2002， 21（4）： 19-21.

[9] 尹俊梅， 王祝年， 楊光穗， 等. 海南野牡丹科野生觀賞植物種質(zhì)資源及其開發(fā)利用[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 26（6）： 63-66.

[10] 朱 純， 陳妙賢， 彭狄周， 等. 10種野牡丹科植物引種栽培及應(yīng)用研究[J]. 中國野生植物資源， 2006， 25（4）： 64-67.

[11] 馬國華， 林有潤， 簡踞光， 等. 野牡丹和地稔的離體培養(yǎng)和植株再生[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2000， 36（3）： 233-234.

[12] 馬國華， 張靜峰， 劉 念， 等. 從多花野牡丹和野牡丹花柄直接誘導(dǎo)出芽[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2005， 40（6）： 719-719.

[13] 何長信， 代色平， 馬國華. 毛菍的組織培養(yǎng)和植株再生[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2009， 45（1）： 49-50.

[14] 彭東輝， 張啟翔， 黃啟堂， 等. 多花野牡丹傳粉生物學(xué)觀察[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2008， 28（2）： 115-120.

[15] 彭東輝， 蘭思仁， 吳沙沙. 中國特有種枝毛野牡丹傳粉生物學(xué)及繁育系統(tǒng)研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究， 2014， 1： 38-42.

[16] 楊利平， 莊 斌， 蘇正華， 等. 野牡丹屬植物種子特征的初步研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2008， 9（2）： 248-252.

[17] 張新華， 代色平， 蔣建友， 等. 野牡丹科6種植物染色體數(shù)目及核型分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2010， 18（4）： 386-390.

[18] 劉雪凝， 屈 平. 5種野牡丹屬植物花粉形態(tài)研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 35（5）： 63-66.

[19] 張 媛， 李 燕， 楊利平. 野牡丹屬植物的細(xì)胞學(xué)研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 11： 121-124.

[20] 戴小紅， 孫偉生， 賀軍軍， 等. 我國野牡丹屬植物的表型多樣性研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 10： 23-26.

[21] 陳進(jìn)燎， 蘭思仁， 吳沙沙， 等. 6種野牡丹屬植物葉片表面特征及其分類學(xué)意義研究[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2013， 2： 54-59.

[22] 鄭 濤， 陳振東， 林秀香， 等. 福建省野牡丹屬種質(zhì)資源的 ISSR分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2013， 21（5）： 406-413.

[23] 葛 娟， 岳慶妮， 王 蕾， 等. 用RAPD和ISSR法研究新疆紅花主栽品種的遺傳多樣性[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009 ， 46（6）： 1 164-1 170.

[24] 繆恒彬， 陳發(fā)棣， 趙宏波. 85個(gè)大菊品種遺傳關(guān)系的ISSR分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2007， 34（5）： 1 243-1 248.

[25] 鄭玉紅， 錢美華， 李 瑩， 等. ISSR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在不同君子蘭品種遺傳多樣性上的應(yīng)用[J]. 北方園藝， 2010（23）： 136-139.

[26] Prashant Shekhar， Gupta Sangeeta， Srivast ava Manoj， 等. 基于RAPD-PCR標(biāo)記的印度亞麻品種遺傳多樣性和指紋圖譜分析[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 41（3）： 201-206.

[27] 袁菊紅， 孫 視， 彭 峰， 等. 石蒜屬植物遺傳多樣性的ISSR和RAPD標(biāo)記比較研究[J]. 中草藥， 2007， 38（10）： 1 555-1 561.