徐迎迅　楊　成

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室　煙臺(tái)　264003；2 菏澤市立醫(yī)院分院普外科

?

miRNA-100對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲遷移力及放射敏感性的影響

徐迎迅1,2楊成1

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室煙臺(tái)264003；2 菏澤市立醫(yī)院分院普外科

【摘要】目的探究miRNA-100對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87侵襲轉(zhuǎn)移能力及放射敏感性的影響。方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)miR-100在NCI-N87細(xì)胞中的表達(dá)量?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測(cè)miR-100對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87放射敏感性、增殖、侵襲、凋亡、遷移及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示miR-100在NCI-N87細(xì)胞中的表達(dá)明顯改變；克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Western blot結(jié)果證實(shí)miR-100可抑制NCI-N87細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高其輻射敏感性。結(jié)論miR-100可抑制NCI-N87細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖侵襲遷移能力，促進(jìn)其凋亡，且提高其輻射敏感性。

【關(guān)鍵詞】miR-100；NCI-N87；放射敏感性；侵襲；轉(zhuǎn)移

胃癌是威脅我國(guó)人民生命健康的最主要惡性腫瘤之一，雖然近年來(lái)胃癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但仍分別居惡性腫瘤的第2位和第3位[1，2]。雖然傳統(tǒng)意義上手術(shù)治療的規(guī)范化及新型抗腫瘤藥物的研發(fā)對(duì)胃癌的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但對(duì)于大部分可手術(shù)的局部進(jìn)展期胃癌或者不可根治的轉(zhuǎn)移性胃癌的診治仍有許多疑難點(diǎn)困擾我們，術(shù)后五年生存率僅30%左右。其臨床生理病理改變復(fù)雜多變且機(jī)理尚未探明。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)內(nèi)生的、長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá),通過(guò)調(diào)控多種通路的靶基因參與多種生物學(xué)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[3，4]。腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與蛋白編碼基因的異常表達(dá)、包括miRNA在內(nèi)的非編碼RNA的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[5，6]本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-100模擬體、抑制劑及陰性對(duì)照后的胃癌細(xì)胞侵襲遷移能力及輻射敏感性的變化。

1.1材料和試劑人胃癌細(xì)胞系NCI-N87購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)并由本實(shí)驗(yàn)室冰凍保存，生長(zhǎng)培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(FBS)DMEM的培養(yǎng)基。按轉(zhuǎn)染條件不同分為mimimc、inhibitor 和nc組。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；miR-100模擬體、抑制劑及陰性對(duì)照劑由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；MMP-2、MMP-9及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染取密度適宜對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，無(wú)酶EP管以DMEM 培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染試劑及miR-100合成產(chǎn)物，5 min內(nèi)混勻，靜置20 min,細(xì)胞無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基換液，加轉(zhuǎn)染復(fù)合體，4～6 h換含10%血清DMEM 培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2Real-time PCR胰酶消化收集細(xì)胞，加TRIzol裂解提取RNA，測(cè)濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-100相對(duì)表達(dá)量。以2^-△△CT表示腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-100mimic、inhibitor后表達(dá)量相對(duì)于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照后miR-100表達(dá)量的變化倍數(shù)。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×103～4個(gè)細(xì)胞/孔接種于 96孔板，設(shè)5個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入 MTT溶液 100 μL，37℃ 4 h，每孔加200 μL DMSO，震蕩10 min，測(cè) 490 nm處OD值。計(jì)算各組細(xì)胞的增值能力。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn)以200、300、3 000、5 000、8 000細(xì)胞數(shù)接種六孔板，分別給予0、2、4、6、8 Gy輻射處理，37 ℃、5% CO2孵育2周，洗滌，固定，Giemsa 染色，計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率及輻射增敏比。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)收集細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞，離心，染色緩沖液重懸細(xì)胞，避光加入PI和Annexin V試劑，室溫孵育 15～30 min，于流式測(cè)定管中上機(jī)檢測(cè)分析。

1.2.6Western blot提取細(xì)胞蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，40 μg上樣量上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，曝光，結(jié)果分析。

1.2.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前Matrigel基質(zhì)膠4℃預(yù)冷成液態(tài)，槍頭預(yù)冷，DMEM培養(yǎng)基1∶5稀釋Matrigel基質(zhì)膠，每小室50 μL，37℃ 1 h，0.5% BSA培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5×105/ml，每孔100 μL，500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入24孔板下室，培養(yǎng)24 h，洗滌2遍，甲醇固定 30 min，Giemsa染液染色 30 min，棉簽擦去上層基質(zhì)膠和未遷移的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)至接近飽時(shí)用無(wú)菌的 200 μL槍頭于標(biāo)記位置劃出等寬的直線劃痕，清洗，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察劃痕的寬度,拍照對(duì)比分析。

2結(jié)果

圖1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-100 mimics，inhibitor圖2miR-100對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 NCI-N87細(xì)胞中miR-100轉(zhuǎn)染效果如圖1所示：NCI-N87細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-100 mimic細(xì)胞組miR-100的相對(duì)表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染 miR-100 NC組，兩組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相反，NCI-N87細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor組miR-100的相對(duì)表達(dá)量明顯低于轉(zhuǎn)染miR-100 NC細(xì)胞組，P<0.01，兩組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，化學(xué)合成的成熟 miR-100可以有效的轉(zhuǎn)染入NCI-N87細(xì)胞，能顯著提高或降低轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-100的表達(dá)量。

及陰性對(duì)照后miR-100相對(duì)表達(dá)量

2.2miR-100抑制NCI-N87細(xì)胞增殖我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-100對(duì)胃癌增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，與轉(zhuǎn)染 NC細(xì)胞組(0.862±0.043)相比，轉(zhuǎn)染 miR-100 mimic細(xì)胞組(0.685±0.023)的增殖力明顯下降，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor組(1.112±0.059)的增殖力明顯提高，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 miR-100降低NCI-N87細(xì)胞侵襲遷移能力我們通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell、及western blot從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及基因?qū)用嫔向?yàn)證miR-100對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。如圖3所示，NCI-N87細(xì)胞劃痕后 48 h miR-100 mimic細(xì)胞組劃痕條帶愈合速度明顯慢于 NC組；相反，細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-34a inhibitor細(xì)胞組的劃痕條帶愈合速度則快于NC組(圖3 A)。轉(zhuǎn)染miR-100 mimic細(xì)胞組(14.67±2.03)平均每視野(×20)穿出小室的細(xì)胞數(shù)與NC細(xì)胞組(23.67±1.76)相比顯著減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染 miR-100 inhibitor (31.67±1.67)組顯示每視野(×20)穿出小室的細(xì)胞數(shù)相對(duì)增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。此外，Western blots對(duì)MMP-2、MMP-9的蛋白水平變化進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平與 miR-100的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(圖3 C)。

2.4miR-100促進(jìn)NCI-N87細(xì)胞凋亡我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-100對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組(13.95±0.72)相比，轉(zhuǎn)染miR-100 mimic細(xì)胞組(20.05±1.23)的凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相反，轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor細(xì)胞組(8.60±0.63)的凋亡率則相應(yīng)的減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5miR-100提高NCI-N87細(xì)胞克隆輻射敏感性克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于陰性對(duì)照組而言，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-100mimic后輻射敏感性顯著增強(qiáng)；而轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor后輻射敏感性顯著降低，見(jiàn)表1。

表1　miR-100對(duì)NCI-N87細(xì)胞輻射敏感性的影響

注：D0為平均致死量；Dq 為準(zhǔn)閥劑量；SER為輻射增敏比。

3討論

miRNA在細(xì)胞分裂、增殖、分化、凋亡以及癌癥形成中發(fā)揮著巨大的作用。miRNA測(cè)定相關(guān)研究揭示不同類(lèi)型癌癥中miRNA水平異于正常,進(jìn)一步研究證明相關(guān)的異常miRNA基因位于癌癥相關(guān)的畸變基因組。大約有30%的蛋白編碼基因是由miRNA調(diào)控的[7]。它可以通過(guò)誘導(dǎo)RISC綁定到目標(biāo)基因來(lái)達(dá)到阻止或延遲靶基因翻譯的作用[8]。許多研究探討過(guò)胃癌中miRNA的表達(dá)譜，在彌散型胃癌中miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-143、miR-145以及miR-133a均是高表達(dá)的[9]。與正常組織相比，在未分化胃癌組織中miR-34b、miR-34c及miR-128a是顯著上調(diào)的而miR-128b、miR-129及miR-148表達(dá)量顯著降低[10]。這些在腫瘤組織中異常表達(dá)的miRNA可能作為腫瘤的預(yù)后指標(biāo)或者診斷生物標(biāo)志物以區(qū)分與正常組織。以上研究都證明miRNA參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展并有可能成為一個(gè)新的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療靶點(diǎn)。

對(duì)于胃癌來(lái)講，臨床多手段多學(xué)科結(jié)合治療已成為一種共識(shí)，而放射治療是腫瘤治療中的重要手段之一。放射治療目的在于控制疾病進(jìn)展，縮小病灶范圍，為手術(shù)創(chuàng)造良好條件。然而由于放射抵抗及腫瘤周邊危及器官耐受量低限制劑量增大等因素往往使放射治療收效甚微甚至失敗，因此，如何克服輻射抵抗，有效的增強(qiáng)胃癌放療敏感性，提高放射治療療效，并尋找新的治療突破點(diǎn)，對(duì)于改善患者生存與生活質(zhì)量具有重要意義。有研究表明，胃癌細(xì)胞的放射敏感性與miRNA等非編碼RNA的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。miRNA可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT來(lái)影響腫瘤細(xì)胞特性，這種機(jī)制可能會(huì)在很大程度上影響胃癌的放射敏感性。此外，外泌體介導(dǎo)的miRNA表達(dá)水平的變化也發(fā)揮著重要作用。

miR-451和miR-221/222 的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞AGS7901的輻射敏感性通過(guò)靶向結(jié)合MIF和PTEN[11]。對(duì)miRNA及涉及腫瘤放射敏感性相關(guān)通路研究的深入為現(xiàn)有的放射治療的改進(jìn)和發(fā)展提供了理論支持和技術(shù)支持，但由于放射治療涉及面廣，機(jī)制復(fù)雜，目前關(guān)于提高胃癌細(xì)胞放射治療的方法仍較局限，miRNA調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞輻射敏感性的具體機(jī)制仍需深入探究。

本研究通過(guò)將miR-100模擬體、抑制劑及陰性對(duì)照劑轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞中人為調(diào)節(jié)miR-100的表達(dá)來(lái)觀察miR-100對(duì)細(xì)胞放射敏感性、增殖、侵襲、凋亡、遷移及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。結(jié)果證實(shí)miR-100可抑制NCI-N87細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡，并且抑制NCI-N87細(xì)胞的侵襲遷移能力，提高其輻射敏感性。目前關(guān)于miR-100對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展及治療的研究仍處于初級(jí)階段，從基因水平探索miRNA對(duì)腫瘤侵襲遷移力及輻射敏感性的影響為腫瘤的臨床治療提供了新的切入點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] Soerjomataram I,Lortet-Tieulent J,Parkin D M,et al.Global burden of cancer in 2008:a systematic analysis of disability-adjusted life-years in 12 world regions[J].Lancet,2012,380(9856):1840-1850.

[2] Ferlay J,Shin H R,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010, 127(12): 2893-2917.

[3] Matsuoka T,Yashiro M.Recent advances in the HER2 targeted therapy of gastric cancer[J].World J Clin Cases,2015,3(1):42-51.

[4] Raver-Shapira N,Marciano E,Meiri E,et al.Transcriptional activation of miR-34a contributes to p53-mediated apoptosis [J].Mol Cell,2007,26(5):731-743.

[5] Brunner T B,Kunz-Schughart L A,Grosse-Gehling P,et al.Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy[J].Semin Radiat Oncol,2012, 22(2):151-174.

[6] Hummel R,Hussey D J,Haier J.MicroRNAs:predictors and modifiers of chemo-and radiotherapy in different tumour types[J].Eur J Cancer,2010,46(2):298-311.

[7] Filipowicz W,Bhattacharyya S N,Sonenberg N.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight[J]? Nat Rev Genet,2008,9(2):102-114.

[8] Carthew R W,Sontheimer E J.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell,2009,136(4):642-655.

[9] Ueda T,Volinia S,Okumura H,et al.Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer:a microRNA expression analysis[J].Lancet Oncol,2010,11(2):136-146.

[10] Katada T,Ishiguro H,Kuwabara Y,et al.microRNA expression profile in undifferentiated gastric cancer[J].Int J Oncol,2009,34(2):537-542.

[11] Bandres E,Bitarte N,Arias F,et al.microRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(7):2281-2290.

Effect of miR-100 on the invasion,migration and radiosensitivity of gastric cancer cells

XU Yingxun1,2YANG Cheng1

1 Department of Anatomy,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University, Yantai 264003, P.R.China;2 Department of General Surgery, Branch Hospital of Heze Municipal Hospitial

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of miR-100 on the invasion,migration andradiosensitivity of NCI-N87 cells.MethodsThe mature type human miR-100 was synthesized chemically.The synthesized miR-100 was transfected into NCI-N87 cells via Lipofectamine-2000. The expression of miR-100 was detected by real-time PCR.MTT assay was used to investigate the function of miR-100 on the proliferation of NCI-N87 cells. Colony-forming assay was used to study the effect of miR-100 on the radio sensitivity of NCI-N87 cells.Flow cytometry was conducted for the detection of cell apoptosis.The invasion of NCI-N87 cells was investigated with Transwell Chamber assay.The metastasis of NCI-N87 cells was detected with cell scratch assay.The expression levels of MMPs were detected with Western blot.ResultsIn order to confirm the biological effects of miR-100 during the development of gastric carcinoma, we synthesized human miR-100 mimic and miR-100 inhibitor, which was transfected into gastric cancer cell lines.Increased miR-100 expression suppressed cell growth,while overexpression of miR100 significantly promoted apoptosis by flow cytometry. Colony-forming assay showed that miR-100 could greatly enhance the radiosensitivity of NCI-N87 cells.Through wound healing test and Transwell migration assay,we observed that transfection of human miR-100 mimic,reduced the migration ability compared with the control group.On the contrary,the function was oppositive treated with miR-100 inhibitor. The expression of MMP-2 and MMP-9 were inhibited showed by Western blot.ConclusionsMiR-100 can inhibit the ability of migration, invasion and proliferation and promote the apoptosis and radiosensitivity of NCI-N87 cells.

【Keywords】miR-100, NCI-N87,radiosensitivity,invasion,migration

(收稿日期：2015-10-26)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R34

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1001-9510(2016)02-0096-04

通訊作者：楊成，E-mail: yangchxn@163.com1材料和方法