徐穎佳,薛贏俊,陸嬋娟

(1.同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200050;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200333)

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·論著·

順鉑作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2后對腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的影響*

徐穎佳1,薛贏俊2,陸嬋娟1

(1.同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200050;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200333)

摘要:目的研究順鉑作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2后對腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的影響。方法培養(yǎng)HepG2人肝癌細(xì)胞,以對數(shù)生長期的細(xì)胞為研究對象,分成對照組和實(shí)驗(yàn)組,對照組不予特殊處理,實(shí)驗(yàn)組予以順鉑處理并測定細(xì)胞生長抑制率、移行愈合率,并測定相關(guān)腫瘤標(biāo)記物P53、caspase-3、caspase-8、CD133、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ABCG2)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等的表達(dá)變化。結(jié)果細(xì)胞生長抑制率：隨著藥物濃度增加而增強(qiáng),與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞移行愈合率：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞移行愈合率明顯低于對照組(P<0.05)，9 μmol/L順鉑組移行愈合率明顯低于6 μmol/L順鉑組(P<0.05)。相關(guān)腫瘤標(biāo)記物P53、caspase-3、caspase-8隨著藥物濃度增加而各指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng),與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞免疫熒光方法顯示隨著順鉑濃度的增加，CD133、ABCG2、ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論順鉑可能通過上調(diào)腫瘤標(biāo)記物P53、caspase-3、caspase-8的表達(dá)，從而抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的生長，并抑制HepG2細(xì)胞的遷移愈合，但會使其耐藥性也增加。

關(guān)鍵詞:順鉑；肝癌；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

原發(fā)性肝癌在我國較為常見，發(fā)病率、病死率較高[1]，大部分患者確診時已喪失手術(shù)機(jī)會，對于這部分的肝癌患者化療為首選治療措施[2]。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。腫瘤干細(xì)胞具有無限增殖、分化的能力，可能具有抵抗化療藥物損傷的作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。P53基因是一種抑癌基因[3]，caspase-8在細(xì)胞凋亡中起重要作用，通過激發(fā)級聯(lián)反應(yīng),活化caspase-3[4]，三者在在肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)探討了順鉑對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖、遷移能力的影響,在細(xì)胞水平上,通過MTT法測定細(xì)胞增殖能力,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移愈合能力,逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測P53、caspase-3、caspase-8的表達(dá)情況,細(xì)胞免疫熒光方法檢測CD133、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ABCG2)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等的表達(dá)，以期為肝癌的藥物治療提供借鑒?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1儀器與試劑細(xì)胞培養(yǎng)基購于GIBCO公司;胎牛血清購自PAA公司,MTT購自Sigma公司;順鉑購自山東齊魯制藥有限公司;Trizol購自海生工生物工程技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司；CD133、ABCG2、ICAM-1抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人HepG2肝癌細(xì)胞株在37 ℃、50 mL/L CO2的環(huán)境下，在含1%青霉素和鏈霉素、100 mL/L的胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組不加入順鉑(空白)，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入順鉑(分為3、6、9、12、15、18、24、30 μmol/L 8個濃度梯度)，每個孔中為100 μL的7×104/mL的人HepG2肝癌細(xì)胞懸濁液,培養(yǎng)48 h后,應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖的情況，記錄吸光度A490值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,重復(fù)3次,求平均值。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組不加入順鉑(空白)，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入順鉑(分為6、9 μmol/L 2個濃度梯度)，每個孔中為600 μL的7×104/mL的人HepG2肝癌細(xì)胞懸濁液。待細(xì)胞鋪滿板底,用無菌20 nL槍頭在24孔板底部劃出一條直線,每孔只劃一次,加入培養(yǎng)基及藥物后培養(yǎng)24 h后,測定移行愈合率：移行愈合率=(初始邊緣距離-24 h后邊緣距離)/初始邊緣距離×100%,重復(fù)3次,求平均值。

1.2.4順鉑對HepG2細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)制的研究細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組為空白，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入順鉑(分為5.4、10.76 μmol/L 2個濃度)，10.76 μmol/L和5.4 μmol/L分別為順鉑作用于人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞48 h的細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)的1/2和1/4，每個孔中為600 μL的7×104/mL的人HepG2肝癌細(xì)胞懸濁液,待細(xì)胞鋪滿板底,加入藥物，培養(yǎng)48 h,提取細(xì)胞總RNA，鑒定P53、caspase-3、caspase-8等相關(guān)RNA的純度和分析濃度，合成cDNA，電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.2.5HepG2腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的檢測實(shí)驗(yàn)分組分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組為空白，實(shí)驗(yàn)組加入順鉑(分為5.4、10.76 μmol/L 2個濃度)，隨后的操作和1.2.4相同,培養(yǎng)48 h后用細(xì)胞免疫熒光方法檢測CD133、ABCG2、ICAM-1的表達(dá)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖能力的測定單獨(dú)運(yùn)用3、6、9、12、15、18、24、30 μmol/L 8個濃度梯度的順鉑作用于人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞48 h后，測定A490值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。各處理組與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。順鉑對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞有抑制增殖的作用，IC50時的順鉑濃度為21.52 μmol/L，藥物抑制作用隨著順鉑濃度的增加而增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　　順鉑作用于HepG2細(xì)胞48 h后對細(xì)胞增殖的

-：該項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

2.2順鉑對HepG2細(xì)胞遷移的影響測定移行愈合率的比較，實(shí)驗(yàn)組(2個濃度)與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組移行愈合率明顯低于對照組。6和9 μmol/L兩個濃度組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，9 μmol/L順鉑組移行愈合率明顯低于6 μmol/L順鉑組。見表2。

表2　　不同濃度順鉑的作用下HepG2細(xì)胞移行愈合率的

2.3順鉑對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用機(jī)制計(jì)算實(shí)驗(yàn)組條帶的光密度值與相應(yīng)的內(nèi)參光密度值的比值然后與對照組進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，順鉑組caspase-3、caspase-8、P53表達(dá)水平上調(diào)。見表3。

表3　　順鉑對HepG2細(xì)胞P53、caspase-3、caspase-8表達(dá)

2.4順鉑對人肝癌細(xì)胞株HepG2腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的影響細(xì)胞免疫熒光方法示，隨著順鉑濃度的增加，CD133、ABCG2、ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)，因此可知，順鉑刺激了腫瘤干細(xì)胞耐藥性的增加。

3討論

順鉑具有廣譜的抗腫瘤作用，影響腫瘤細(xì)胞代謝周期，促進(jìn)其凋亡，有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。原發(fā)性肝癌在我國較為常見，發(fā)病率、病死率較高，首選的治療措施是手術(shù)切除,但本病發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，已喪失手術(shù)機(jī)會，對于這部分的肝癌患者化療為首選措施，所以順鉑被常用于肝癌的化療。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，腫瘤干細(xì)胞具有無限增殖、分化的能力，可能具有抵抗化療藥物損傷的作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移，在腫瘤增殖、分化中P53、caspase-3、caspase-8的表達(dá)起到重要作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)探討了順鉑對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。在細(xì)胞水平上,通過MTT法測定細(xì)胞增殖能力,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移愈合能力,RT-PCR檢測P53、caspase-3、caspase-8的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)中用3、6、9、12、15、18、24、30 μmol/L 8個濃度的順鉑分別作用于人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞48 h后，測定A490值、細(xì)胞增殖抑制率，發(fā)現(xiàn)順鉑對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞有抑制增殖的作用，藥物抑制作用隨著順鉑濃度的增加而增強(qiáng)。順鉑的IC50為21.52 μmol/L。6和9 μmol/L濃度的實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的移行愈合率明顯低于對照組;6和9 μmol/L濃度下的實(shí)驗(yàn)組比較,高濃度順鉑組移行愈合率明顯低于低濃度的順鉑組。順鉑作用于HepG2細(xì)胞48 h使caspase-3、caspase-8、P53表達(dá)水平上調(diào)可能是其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。CD133是腫瘤干細(xì)胞的廣譜標(biāo)志物之一，ABCG2是腫瘤細(xì)胞逃避藥物作用的標(biāo)志物之一，ICAM-1是一細(xì)胞黏附分子，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞免疫熒光方法顯示：隨著順鉑濃度的增加，CD133、ABCG2、ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)，因此可知，順鉑刺激了腫瘤干細(xì)胞耐藥機(jī)制的加強(qiáng)。

綜上所述，順鉑作用于肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞后，可能通過上調(diào)腫瘤標(biāo)記物P53、caspase-3、caspase-8表達(dá)，從而抑制人HepG2肝癌細(xì)胞的生長，并抑制人HepG2腫瘤細(xì)胞的遷移愈合，且隨著藥物濃度增加而抑制作用增強(qiáng)。但是順鉑在應(yīng)用于肝癌患者后普遍出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，對于其耐藥機(jī)制的研究還有待于進(jìn)一步完善[8-10]。

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The effects of cisplatin on cancer stem cell markers of hepatocellular carcinoma cell line HepG2*

XuYingjia1,XueYinjun2,LuChanjuan1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TongrenHospital，Shanghai200050,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,LonghuaHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200333,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of cisplatin on the expression of tumor stem cell markers in human hepatoma cell line HepG2.MethodsThe cultured human hepatoma HepG2 cells in logarithmic growth phase were used for the study,which were divided into control(no special treatment was administrated) and experimental groups(cisplatin was added),then the rates of cell growth inhibition,transitional healing rates and changes in tumor associated markers associated P53,caspase-3,caspase-8，CD133，adenosine triphosphate-binding cassette superfamily G member 2(ABCG2)，intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1) were measured.ResultsComparison of cell growth inhibition:with the increase of drug concentration increased,compared with the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).Transitional healing rate:with the increase of drug concentration,compared with the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).The expression of related tumor markers P53,caspase-3,caspase-8 increased while the drug concentrations increase and were higher in the control group(P<0.05),the difference were statistically significant.In the immunofluorescence for the detection of CD133,ABCG2,ICAM-1,the fluorescence intensity increased with the concentrations of cisplatin.ConclusionCisplatin could inhibit the growth of tumor cells by up-regulating the tumor markers such as P53,caspase-3 and caspase-8.The migration of tumor cells in cell scratch test could also be inhibited by cisplatin while their drug resistance were enhanced.

Key words:cisplatin;liver cancer;cancer stem cells;cell proliferation;cell cycle

(收稿日期：2015-12-25)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.003

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1023-03

基金項(xiàng)目：上海市藥學(xué)會醫(yī)院藥學(xué)科研基金(2012-YY-01-02)。

作者簡介：徐穎佳，女，檢驗(yàn)師，主要從事免疫分子生物學(xué)方面的研究。