李佑鋒，彭　浩，高建芳，高　晶，陳　宇，吳秀山，李永青

(湖南師范大學蛋白質(zhì)化學及魚類發(fā)育生物學教育部重點實驗室心臟發(fā)育研究中心， 中國 長沙　410005)

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TCF25干擾慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

李佑鋒，彭浩，高建芳，高晶，陳宇，吳秀山，李永青*

(湖南師范大學蛋白質(zhì)化學及魚類發(fā)育生物學教育部重點實驗室心臟發(fā)育研究中心， 中國 長沙410005)

摘要為構(gòu)建一個針對TCF25(transcription factor 25)基因的慢病毒干擾載體, 設計并合成3組針對TCF25的短發(fā)夾RNA序列 (shRNA)，通過基因重組技術(shù)連入 pLL3.7載體，酶切鑒定及DNA測序后，重組正確的pLL3.7質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞，培養(yǎng)48 h后，分別收集細胞培養(yǎng)上清液，感染H9C2細胞，Western-blot檢測TCF25在H9C2細胞中的表達．結(jié)果顯示TCF25蛋白在H9C2細胞中的表達被抑制．這說明TCF25的慢病毒干擾載體構(gòu)建成功．

關(guān)鍵詞TCF25基因；293FT細胞；H9C2 細胞；慢病毒載體

TCF25(transcription factor 25)是在小鼠胚胎發(fā)育過程中廣泛表達的一個含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，且其C端還含有一個功能未知的DUF654結(jié)構(gòu)域．根據(jù)TCF25廣泛的表達模式和包含的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，推測其可能在腦和心臟等各種器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1-3]．同時，已有研究表明TCF25作為SRF信號通路的抑制因子調(diào)控基因的表達，且能夠抑制P19CL6細胞向心肌細胞分化[4]，但其具體作用機制需要繼續(xù)探索．

RNA干擾(RNA interference，縮寫RNAi)是指在進化過程中高度保守的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，能夠特異性剔除或關(guān)閉靶基因的表達[5]．目前，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和基因治療領域等[6]．RNAi技術(shù)主要是將siRNA序列設計為一段shRNA(short hairpin RNA，短發(fā)夾RNA)克隆進質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)染細胞后被轉(zhuǎn)錄形成一個雙鏈RNA誘導基因沉默發(fā)生．慢病毒載體是根據(jù)HIV病毒基因特征，利用其基因結(jié)構(gòu)重組構(gòu)建而成．其能夠?qū)⑼庠茨康幕蚧蛲庠吹膕hRNA高效地整合到宿主基因組上并持久表達[7-8]．慢病毒載體能夠高效地感染心肌細胞、腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞等各類細胞系．同時，對于原代細胞和不分化細胞等較難轉(zhuǎn)染的細胞，慢病毒載體也能夠大大提高目的基因的轉(zhuǎn)染效率和基因整合到宿主細胞基因組上的幾率．基于其強大的轉(zhuǎn)染能力，慢病毒載體已經(jīng)被廣泛應用于基礎和臨床醫(yī)學研究[9-10]．

為將TCF25的shRNA高效且穩(wěn)定地導入各類細胞中，本實驗擬構(gòu)建針對TCF25的重組慢病毒載體，用于研究TCF25的功能機制．

1材料與方法

1.1材料

1.1.1載體慢病毒載體系統(tǒng)為3質(zhì)粒系統(tǒng)，包括pLL3.7，pMD-G，psPAX2(為本實驗室保存質(zhì)粒)．

1.1.2細胞慢病毒包裝細胞293FT細胞株，H9C2細胞，COS7細胞，分離的新生大鼠心肌細胞(本實驗室保存細胞和分離)．

1.1.3試劑及儀器XhoⅠ,HpaⅠ,NotⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶,T4連接酶購自上海生工公司；DH5α感受態(tài)為本實驗室制備和保存；胎牛血清、細胞高糖培養(yǎng)基DMEM和抗生素購自Invitrogen公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自康為世紀生物公司；凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；TCF25抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司；β-actin抗體和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體購自康為世紀生物公司；倒置熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司；PBS，無水乙醇，Ampicillin和5×SDS上樣緩沖液等常用試劑購自上海生工公司；PCR儀、移液槍和CO2培養(yǎng)箱購自德國Eppendorf公司．

1.2方法

1.2.1TCF25基因干擾寡核苷酸的合成利用shRNA在線設計工具針對TCF25基因的核苷酸序列設計3對shRNA單鏈寡核苷酸片段，干擾shRNA中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號．見表1．設計完成后由上海生工生物公司合成．

表1　shRNA干擾引物序列

1.2.2重組慢病毒干擾質(zhì)粒pLL3.7-TCF25-RNAi的構(gòu)建首先將合成的引物配對退火；取2 μg的pLL3.7載體質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ/HpaⅠ雙酶切后凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物；pLL3.7載體質(zhì)粒膠回收產(chǎn)物與引物退火后產(chǎn)物用T4連接酶連接，16 ℃恒溫水浴1 h；連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，選擇Amp抗性LB固體培養(yǎng)基平板進行涂板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜；第二天挑菌體單克隆接種到含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜；質(zhì)粒提取，酶切和測序鑒定．序列比對正確后，高純度去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量抽提試劑盒抽提正確重組的pLL3.7干擾質(zhì)粒，用于包裝病毒．

1.2.3慢病毒的包裝與收集用已經(jīng)培養(yǎng)了24 h的293 FT cells進行病毒的制備：

(a) 取1 mL無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液加入EP管中，依次加入：插入shRNA的pLL3.7-TCF25-RNAi質(zhì)粒8 μg,pMD-G (envolope plasmid)4 μg,psPAX2 (package plasmid)6 μg；再加入Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑36 μL，移液槍吸打混勻后室溫下靜置30 min；

(b) 給293FT細胞更換預熱的新DMEM培養(yǎng)液(5 mL/培養(yǎng)皿)，然后用1 mL槍將上步配好的轉(zhuǎn)染溶液均勻地滴加在培養(yǎng)液液面上輕輕搖勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；

(c) 12 h后更換10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液12 mL，24 h后進行GEP綠色熒光表達的檢測并開始收集被感染細胞的培養(yǎng)液和換新培養(yǎng)液，連續(xù)收集3天，共36 mL于一個50 mL離心管中；

(d) 2 000 r/min在4 ℃下離心10 min，取上清；

(e) 0.45 μm濾器過濾各組干擾TCF25慢病毒上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

M：DNA標準　圖1　對照組pLL3.7和pLL3.7-TCF25-RNAi重組質(zhì)粒DNA酶切鑒定圖　Fig.1　Identification of plasmid pLL3.7 and pLL3.7-TCF25-RNAi by restriction enzyme digestion

1.2.4H9C2細胞中篩選TCF25基因有效干擾序列慢病毒感染細胞前一天將H9C2細胞接種到6孔培養(yǎng)皿中，待細胞濃度為60%～75%時吸去舊培養(yǎng)基，向H9C2細胞中分別加入不含抗生素、10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液500 μL和慢病毒上清液500 μL，包括未重組pLL3.7(對照組)組、TCF25-RNAi1組、TCF25-RNAi2組、TCF25-RNAi3組；病毒感染24 h后將培養(yǎng)液換為新鮮的10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后觀察GFP綠色熒光蛋白的表達；轉(zhuǎn)染72 h后，收集細胞；蛋白提取，取1 mL 過濾滅菌后的PBS清洗細胞2次，加100 μL含蛋白酶抑制劑PMSF(1∶100)的RIPA細胞強裂解液裂解細胞，反復凍融3次；用移液槍吸取裂解液到1.5 mL EP管中， 4 ℃，13 000 g離心10 min，取上清即為蛋白溶液；按比例加入5×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5 min； 自然冷卻后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜．封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉1 h，TBST稀釋的TCF25一抗(1∶250)4 ℃過夜或者室溫2 h，TBST稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫1 h，內(nèi)參蛋白抗體為β-actin，各過程間用TBST洗膜3次，每次10 min；顯影，蛋白表達結(jié)果分析．

1.2.5觀察指標重組慢病毒干擾質(zhì)粒酶切電泳圖和質(zhì)粒測序結(jié)果，慢病毒感染細胞后GFP熒光檢測，TCF25蛋白的表達．

2結(jié)果

2.1pLL3.7-TCF25-RNAi重組質(zhì)粒酶切和測序結(jié)果

見圖1，將構(gòu)建的pLL3.7-TCF25-RNAi1組、pLL3.7-TCF25-RNAi2組和pLL3.7-TCF25-RNAi3重組質(zhì)粒DNA和對照組PLL3.7通過XbaⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，凝膠電泳圖顯示對照組在450 bp處都會切出一條帶，3個實驗組在500 bp處都會有一條帶，較對照組條帶大50 bp左右，證明干擾序列成功連入pLL3.7質(zhì)粒．

測序結(jié)果證實3組pLL3.7-TCF25-RNAi重組質(zhì)粒DNA上均含有實驗設計并合成的干擾靶序列，表明實驗成功將TCF25的shRNA雙鏈DNAoligo(干擾引物退火產(chǎn)物)精確地插入pLL3.7載體中，成功構(gòu)建了干擾TCF25基因mRNA的pLL3.7重組載體質(zhì)粒．見圖2．

圖2　pLL3.7-TCF25-RNAi1，pLL3.7-TCF25-RNAi2 和pLL3.7-TCF25-RNAi3質(zhì)粒DNA 測序結(jié)果Fig.2　DNA sequencing of pLL3.7-TCF25-RNAi1, pLL3.7-TCF25-RNAi2 and pLL3.7-TCF25-RNAi3 plasmids

2.2TCF25干擾重組慢病毒的包裝和收集

pLL3.7空質(zhì)粒和3組pLL3.7-TCF25-RNAi重組質(zhì)粒分別同慢病毒包裝質(zhì)粒 pMD-G 和psPAX2 共同轉(zhuǎn)染293FT細胞，24 h后可見GFP大量表達．連續(xù)收集3 d感染細胞上的培養(yǎng)基共36 mL于一個50 mL離心管中．2 000 r/min在4 ℃下離心10 min，取上清．將各組RNA干擾質(zhì)粒包裝的病毒上清液以0.45 μm過濾器過濾，-80 ℃保存．見圖3(彩圖見封三)．

2.3TCF25重組慢病毒感染H9C2細胞的GFP熒光檢測

將包裝好的TCF25干擾重組慢病毒上清液轉(zhuǎn)染目的細胞H9C2細胞，48 h后，熒光顯微鏡觀察到較強的綠色熒光表達，證實包裝的慢病毒成功轉(zhuǎn)染H9C2細胞．見圖4(彩圖見封三)．

圖3　重組質(zhì)粒pLL3.7-TCF25-RNAi同慢病毒包裝質(zhì)粒 pMD-G 和psPAX2 共轉(zhuǎn)染293FT細胞后熒光檢測結(jié)果Fig.3　The green florecence result for contransfecting 293FT cells with pLL3.7-TCF25-RNAi, pMD-G and psPAX2

圖4　TCF25-RNAi載體慢病毒轉(zhuǎn)染H9C2 細胞熒光檢測結(jié)果(×200)Fig.4　Observation of TCF25-RNAi lentiviral vector transfected H9C2 cells with fluorescence microscopy(×200)

2.4Western-blot 檢測慢病毒感染后TCF25蛋白表達情況

對各組TCF25重組慢病毒感染后的H9C2細胞總蛋白提取，WB檢測TCF25蛋白表達情況．與對照組pLL3.7相比，可觀察到RNAi1組、RNAi2組、RNAi3組中TCF25蛋白表達均被抑制，其中RNAi2組中TCF25表達被抑制最明顯，表明TCF25-RNAi2干擾序列為最佳干擾靶點．見圖5．

圖5　Western-blot 檢測TCF25的表達Fig.5　Western-blot detection of the expression of TCF25

2.5TCF25重組慢病毒感染分離的新生大鼠心肌細胞和COS7細胞

為了進一步鑒定已包裝的TCF25-RNAi載體慢病毒的高效感染能力，檢測其對其他細胞的感染活性，分別轉(zhuǎn)染分離的新生大鼠心肌細胞和COS7細胞后都能明顯檢測到GFP熒光蛋白的表達．見圖6和圖7(彩圖見封三)．

圖6　TCF25-RNAi載體慢病毒感染分離心肌細胞熒光檢測結(jié)果(×200)Fig.6　Observation of TCF25-RNAi lentiviral vector transfected cardiomyocyte cells with fluorescence microscopy(×200)

圖7　TCF25-RNAi載體慢病毒感染COS7細胞熒光檢測結(jié)果(×100)Fig.7　Observation of TCF25-RNAi lentiviral vector transfected COS7 cells with fluorescence microscopy(×100)

3討論

2014年末美國心臟協(xié)會(AHA)對心臟病和卒中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，在全球范圍內(nèi)心血管疾病仍然是死亡的主要原因，每年奪去1 730萬人的生命．心血管疾病不再只是西方世界的疾病，全球低、中收入國家中80%的死亡是由心血管疾病引起的[11]．對心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進行研究，將為心臟病的臨床預防和治療提供新的思路和策略．

bHLH(basic Helix-Loop-Helix，堿性螺旋-環(huán)-螺旋)蛋白是一類真核生物中轉(zhuǎn)錄因子大家族．bHLH蛋白含有2個保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，分別為一個能與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域和α螺旋-環(huán)-α螺旋結(jié)構(gòu)組成．1989年，在小鼠中bHLH轉(zhuǎn)錄因子(E12和E47)首次被鑒定出，隨后在各物種得到廣泛的鑒定．目前，其轉(zhuǎn)錄功能在哺乳動物類內(nèi)研究最為透徹，參與調(diào)控生物體的諸多生命活動，如肌細胞生成、神經(jīng)元發(fā)生、性別決定和細胞增殖等[11-15]．TCF25屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員，在小鼠和人類各組織中廣泛表達，尤其在胚胎發(fā)育階段高表達．有研究表明TCF25作為一個轉(zhuǎn)錄抑制因子對SRF信號通路起著極強的抑制作用．同時還有研究發(fā)現(xiàn)TCF25基因抑制P19CL6細胞向心肌細胞分化．由此可見，TCF25對于心臟發(fā)育具有非常重要的調(diào)控功能．

RNAi技術(shù)是通過在細胞內(nèi)形成短的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)來介導目的靶mRNA特異性的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平實現(xiàn)目的基因的沉默．RNAi效應由大小為21～23 bp的shRNA分子所介導，針對目的mRNA不同位點設計的shRNA表現(xiàn)明顯不同的活性．shRNA介導的基因沉默效率主要取決于其21～23 bp個堿基序列的合理設計，本實驗設計了3對針對TCF25基因mRNA序列不同位點的shRNA干擾引物，分別與pLL3.7質(zhì)粒連接，成功構(gòu)建了3對pLL3.7-TCF25重組載體質(zhì)粒，經(jīng)過酶切電泳和質(zhì)粒測序證明與實驗設計合成的靶向鏈完全一致．病毒載體介導shRNA的表達與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，具有感染效率高和轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定的優(yōu)勢．本實驗所用病毒包裝系統(tǒng)為3質(zhì)粒系統(tǒng)，分別為病毒包裝質(zhì)粒 pMD-G和psPAX2及高效重組載體pLL3.7．其中pLL3.7質(zhì)粒含有能表達綠色熒光蛋白(GFP)元件，pMD-G和psPAX2含有病毒包裝所必須的元件．

TCF25-RNAi載體慢病毒轉(zhuǎn)染H9C2細胞后， Western-blot檢測表明目的蛋白TCF25表達量顯著降低；在設計的3個靶點中，第2個靶序列對目的基因表達的干擾作用最明顯，為最佳靶點．同時在其他細胞系中實驗證明包裝的TCF25-RNAi載體慢病毒具有較高的轉(zhuǎn)染效率，為后期進一步研究TCF25基因在心臟發(fā)育中的作用機制奠定了良好的基礎．

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(編輯WJ)

Construction and Characterization of a Lentiviral Vector for RNA Interference ofTCF25

LIYou-feng,PENGHao,GAOJian-fang,GAOJing,CHENYu,WUXiu-shan,LIYong-qing*

(Center for Heart Department, Key lab of MOE for Department Biology and Protein Chemistry,Hunan Normal University, Changsha 410005, China)

AbstractObjectiveTo construct a lentiviral vector for RNA interference of TCF25 (transcription factor 25) gene and identify it. MethodsThree pairs of complementary short hairpin RNA (shRNA) oligonucleotides targeting the TCF25 gene were designed, synthesized, and then inserted into pLL3.7 vectors by gene recombination technology. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. Correct recombinant plasmids were cotransfected with packaging plasmids into 293FT cells. The cell culture supernatant was obtained after 48 hours, and then applied to infect H9C2 cells. The expression of TCF25 in H9C2 cells was detected by western-blot. ResultsThe recombinant plasmid was successfully constructed. The western-blot showed that the expression of TCF25 in H9C2 cells was inhibited after the cells were successfully infected with the lentiviral vector supernatant. ConclusionThe lentiviral vector interfering TCF25 was constructed successfully.

Key wordsTCF25 gene; 293FT cell; H9C2 cell; lentiviral vector

中圖分類號Q786

文獻標識碼A

文章編號1000-2537(2016)02-0023-06

*通訊作者,E-mail：liyongqing2002cn@aliyun.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81270156，81470377)；湖南省社會發(fā)展支撐計劃資助項目(2014SK3009)；湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(2013-448-6)

收稿日期：2015-04-08

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.02.004