敖其爾 烏仁圖雅

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

實驗研究

蒙藥珍寶丸對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的影響及ICAM-1，Caspase-3的表達(dá)

敖其爾 烏仁圖雅*

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

觀察ICAM-1，caspase-3在RIR損傷中的表達(dá)及蒙藥珍寶丸對其的影響并探討其對RIR損傷中的保護(hù)作用。方法：用升高眼壓的方法制作兔視網(wǎng)膜缺血模型，在不同時間觀察95只家兔視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變及ICAM-1，caspase-3的表達(dá)。結(jié)果：模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)減少，出現(xiàn)大量的水腫和空泡，內(nèi)核層細(xì)胞排列紊亂。缺血再灌注后6h起改變明顯，24h達(dá)到高峰72h水腫和空泡減少，視網(wǎng)膜明顯變薄。珍寶丸組水腫和空泡現(xiàn)象較模型組輕，內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)較模型組多，視網(wǎng)膜較厚，細(xì)胞排列有序。ICAM-1，caspase-3的表達(dá)6h起明顯，24h達(dá)到高峰，72h仍少量表達(dá)。珍寶丸治療組各觀察指標(biāo)表達(dá)變化規(guī)律與缺血再灌注組基本一致，但均較缺血再灌注組明顯下降。結(jié)論：1.RIR損傷中ICAM-1，caspase-3的表達(dá)增高。2.珍寶丸對RIR損傷中ICAM-1，caspase-3的表達(dá)有抑制作用。3.珍寶丸對RIR損傷有保護(hù)作用。

RIR損傷;珍寶丸;ICAM-1;caspase-3

珍寶丸又名額爾敦-烏日勒，是臨床上常用的傳統(tǒng)蒙藥。有清陳熱，祛黃水，護(hù)白脈等功能[1]。本方性涼，是蒙醫(yī)在臨床治療腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和各種疑難病的常用藥。珍寶丸以其組方主從關(guān)系嚴(yán)謹(jǐn)，用藥量少，藥力獨到，療效卓著的特點，具有“神藥”之稱[2]。 為探討珍寶丸對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的作用及原理本實驗對RIR損傷中ICAM-1，caspase-3表達(dá)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 動物與分組:健康成年無眼疾家兔95只，體重2.5～3kg，隨機分為正常組(5只)、模型組(30只)、珍寶丸組(30只)、維生素E組(30只)。后三組根據(jù)缺血再關(guān)注時間分為1h、6h、12h、24h、48h、72h組，每組(5只)。

1.2 主要試劑和設(shè)備:蒙藥珍寶丸由內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司提供。維他命E由浙江醫(yī)藥股份有限公司提供。ICAM-1免疫組化試劑盒，Caspase-3免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，Poly-L-Lysine粘片劑由北京來福試劑公司提供。SABC試劑盒由武漢博士德公司提供。OLYMPUS光學(xué)顯微鏡，顯微攝像系統(tǒng)由日本生產(chǎn)。OPTONVIDAS圖像分析儀由德國生產(chǎn)。YZ直接檢眼鏡由蘇州醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

1.3 動物模型的制備:RIR組、珍寶丸組和VE組動物稱重后采用20%烏拉坦5ml/kg從耳緣靜脈輸入，同時兔眼滴用1%的地卡因表面麻醉，復(fù)方托品酞胺散瞳。麻醉成功后固定于自制的固定板上，將連接生理鹽水瓶輸液管的7號針頭刺入兔右眼前房，避免損傷虹膜及晶狀體，然后升高輸液瓶至與實驗眼垂直距離150cm處，此高度在眼內(nèi)形成110mmHg(14.46kpa)的眼內(nèi)壓，此壓力接近兔的體循環(huán)收縮壓[4]。能完全造成視網(wǎng)膜血流阻斷，直接檢眼鏡下可見視網(wǎng)膜蒼白水腫，眼底血流阻斷；維持60分鐘后緩慢降低生理鹽水瓶至與家兔在同一水平，使視網(wǎng)膜恢復(fù)血液供應(yīng)，留針1分鐘，拔除穿刺針，結(jié)膜囊涂紅霉素眼膏防止感染，分籠飼養(yǎng)。期間每日雙眼滴氯霉素眼藥水2次維持角膜濕潤和防止感染。

1.4 給藥方法:在造模前7天連續(xù)灌胃給藥，珍寶丸組0.15g/kg和VE組100mg/kg(1次/日)。正常組和模型組給予等量生理鹽水。再灌注期間也同樣劑量給藥。

1.5 試驗方法

1.5.1 標(biāo)本制作:分別于再灌注后1h、6h、12h、24h、48h、72h采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死動物，立即摘除眼球，4%多聚甲醛中性緩沖液固定24h。流水沖洗24h，脫水，透明，包埋，連續(xù)切片(厚度4um)。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

1.5.2 ICAM-1，caspase-3的免疫組化檢測切片用SABC免疫組化法染色，按ICAM-1，caspase-3試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。圖像分析系統(tǒng)觀察拍照。

1.5.3 統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。測定結(jié)果以X±S表示。組間進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行兩兩比較，組內(nèi)各時段做隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜的ICAM-1的表達(dá)

正常組：視網(wǎng)膜中ICAM-1微量表達(dá)。

模型組：缺血再灌注6h始在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層，內(nèi)外核層少量表達(dá)，12h表達(dá)明顯升高，24h(圖1)達(dá)到高峰，48h始表達(dá)下降，72h仍少量表達(dá)。

珍寶丸組：視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達(dá)變化規(guī)律與模型組相似，平均表達(dá)量較RIR組少，各時段表達(dá)量較RIR組相同時段少。

VE組：各時段表達(dá)均較RIR組相同時段低，各個時段表達(dá)均較珍寶丸組高(表1)。

表1 視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后不同時段ICAM-1的表達(dá)變化(灰度，單位：um)

注：灰度值范圍在0～255,0為最黑，255為最亮。各組與正常組、模型組、VE組、給藥組有統(tǒng)計學(xué)意義的依次標(biāo)為1、2、3、4.

2.2 視網(wǎng)膜的Caspase-3的表達(dá)

正常組：視網(wǎng)膜中Caspase-3微量表達(dá)。

模型組：缺血再灌注6h始在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)核層，內(nèi)網(wǎng)織層表達(dá)開始明顯。 24h達(dá)到高峰(圖2)。48h始表達(dá)下降，72h仍少量表達(dá)。

珍寶丸組：視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達(dá)變化規(guī)律與模型組相似，平均表達(dá)量較RIR組少，除1h組各時段表達(dá)量較RIR組相同時段少。

VE組：除1h組各時段表達(dá)均較RIR組相同時段低，除1h組各個時段表達(dá)均較珍寶丸組高(見表2)。

表2 視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后不同時段Caspase-3的表達(dá)變化(灰度，單位：um)

注：灰度值范圍在0～255,0為最黑，255為最亮。各組與正常組、模型組、VE組、給藥組有統(tǒng)計學(xué)意義的依次標(biāo)為1、2、3、4.

2.3 RIR損傷的組織病理學(xué)改變：模型組1h組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層和內(nèi)叢狀層出現(xiàn)輕度水腫，6h組水腫明顯，少量空泡出現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少。12h后水腫和空泡現(xiàn)象嚴(yán)重，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)一步減少，排列稀疏。內(nèi)外核層密度均降低，排列紊亂，出現(xiàn)核碎裂，溶解和壞死。72h視網(wǎng)膜明顯變薄，水腫減輕，細(xì)胞數(shù)量稀少。珍寶丸組水腫和內(nèi)外核層密度降低等現(xiàn)象輕且出現(xiàn)時間晚。節(jié)細(xì)胞排列較規(guī)整，數(shù)量也多于未治療組。

3 結(jié)論

從上述結(jié)果中得出以下結(jié)論：ICAM-1，caspase-3在24h灰度最小，說明表達(dá)最強。損傷最嚴(yán)重。珍寶丸組的平均灰度高于模型組和VE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明珍寶丸對ICAM-1，caspase-3的表達(dá)有抑制作用，對視網(wǎng)膜缺血再關(guān)注損傷有保護(hù)作用。

4 討論

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科常見的病理學(xué)改變。如視網(wǎng)膜中央動脈阻塞、分支動脈阻塞、青光眼、缺血性視神經(jīng)病變等, 均可造成視網(wǎng)膜組織的缺血。在血液再通后, 往往對視網(wǎng)膜造成更為嚴(yán)重的損傷。因此, 積極探尋各種保護(hù)視網(wǎng)膜再灌注損傷的治療方法具有重要的臨床意義[4]。目前的研究表明它是多種因素綜合作用的結(jié)果,如氧自由基的損傷、微血管的損傷、白細(xì)胞的作用和鈣超載等[5]。目前研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中存在著神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象, 且凋亡是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞丟失的重要因素之[6]。其中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1) 是在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白家族成員之一。它可作為配基與白細(xì)胞表面的VFA-1 和MAC-1 分子結(jié)合,介導(dǎo)白細(xì)胞與血管壁內(nèi)細(xì)胞的黏附及白細(xì)胞穿出血管壁,從而導(dǎo)致缺血再灌注組織的損傷[7]。凋亡蛋白酶(caspases)是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。目前已發(fā)現(xiàn)該蛋白酶家族至少有13個成員，caspase在凋亡中所起的主要作用是：滅活細(xì)胞凋亡的抑制物；水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)體，形成凋亡小體：在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白，從而使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能[8]。其中caspase-3是哺乳類動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序的特異性標(biāo)志物。一般認(rèn)為它在細(xì)胞凋亡過程中是最重要的終末剪切酶,在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的劊子手作用。[9]

蒙藥珍寶丸又名額爾敦烏日勒，出自《秘訣增補篇》。是由珍珠、麝香、牛黃等珍貴藥品組成的傳統(tǒng)蒙藥。主治白脈病，黑脈病，中風(fēng)，痛風(fēng)及各種頑癥。藥理試驗證明此藥具有擴(kuò)張毛細(xì)血管，促進(jìn)微循環(huán)，降低血黏度，促進(jìn)血液流通，減慢心率，降低心臟耗氧率，提高缺氧耐受度，抗血小板凝集，抗血栓形成，恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷，抗脂肪酸過氧化，清除氧自由基等作用[10]。據(jù)報道蒙藥珍寶丸具有明顯改善急性血瘀癥模型大鼠異常的血液流變學(xué)狀態(tài)，明顯抑制異常增高的血細(xì)胞聚集作用[11]。對氧自由基有很強的清除和抑制作用[12]。對腦缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用[13]。

我們通過兔RIR模型中應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測了，caspase-3的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜缺血再灌注后ICAM-1，caspase-3表達(dá)增加，缺血再灌注后6h開始表達(dá)明顯，24h達(dá)高峰，48h后漸減少，至72h仍有表達(dá)。珍寶丸治療組各觀察指標(biāo)表達(dá)變化規(guī)律與RIR組基本一致，但均較RIR組明顯下降。本研究顯示，在RIR損傷中珍寶丸能降低ICAM-1，caspase-3的表達(dá)，且在一定程度上能夠減輕視網(wǎng)膜組織的損傷。但因具體機理十分復(fù)雜，闡述還遠(yuǎn)不夠完善，尚待進(jìn)一步研究。

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2016年6月20日收稿

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1006-6810(2016)10-0059-03