薛春旭，　陳　威，　周宇芳，　朱　鵬*（.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波5；.平陽(yáng)縣海洋與漁業(yè)局，浙江溫州5400；.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江舟山600）

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海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.NJ631膠原蛋白酶的克隆與表達(dá)

薛春旭1，陳威2，周宇芳3，朱鵬*1
（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.平陽(yáng)縣海洋與漁業(yè)局，浙江溫州325400；3.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江舟山316100）

摘要：對(duì)交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組中潛在的膠原蛋白酶基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，并鑒定重組蛋白PNJC的酶活力。根據(jù)NJ631基因組序列草圖，利用基因組信息發(fā)掘方法獲得膠原蛋白酶功能提示的編碼基因，進(jìn)而利用高效表達(dá)質(zhì)粒pET28a構(gòu)建重組表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化獲得重組蛋白純化產(chǎn)物。以不溶性Ⅰ型膠原蛋白為底物，測(cè)定膠原蛋白酶酶活力。對(duì)Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組信息挖掘，從中發(fā)現(xiàn)一條疑似編碼膠原蛋白酶的基因序列，命名為Pnjc。該基因全長(zhǎng)1 359 bp，GC含量45.62%，編碼由452個(gè)氨基酸殘基組成的約51 000大小的膠原蛋白酶。SDS-PAGE檢測(cè)表明，膠原蛋白酶PNJC在0.2 mmol/ L的IPTG誘導(dǎo)下得到高效表達(dá)。經(jīng)過(guò)親和層析獲得純化重組蛋白PNJC，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為1 mg/mL。酶活檢測(cè)表明，PNJC的酶活力為160.34 U/mg，為標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%。PNJC高酶活力表明，Pseudoalteromonas sp.NJ631來(lái)源的膠原蛋白酶具有重要的研究?jī)r(jià)值與工業(yè)開(kāi)發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞：交替假單胞菌；膠原蛋白酶；基因組發(fā)掘；酶活檢測(cè)

膠原蛋白酶是一類(lèi)特異性作用于膠原蛋白或其它變性明膠的酶類(lèi)。它在醫(yī)學(xué)[1-2]、基礎(chǔ)研究[3]、環(huán)境保護(hù)[4]等方面有著重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。膠原蛋白酶來(lái)源豐富，除動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的膠原蛋白酶外，梭菌、弧菌等微生物也能產(chǎn)生膠原蛋白酶[5-6]。微生物由于種類(lèi)多，特異性強(qiáng)，基因資源豐富，具有動(dòng)物無(wú)法比擬的天然優(yōu)勢(shì)。微生物來(lái)源的膠原蛋白酶的研究開(kāi)發(fā)將為我們篩選酶活更高、特異性更強(qiáng)的潛在工業(yè)化的膠原蛋白酶。

基因組測(cè)序技術(shù)的快速更替帶來(lái)了基因組數(shù)據(jù)的爆炸性增長(zhǎng)，利用基因組發(fā)掘（Genome Mining）方法為膠原蛋白酶編碼基因的快速發(fā)掘及其功能研究提供了高效平臺(tái)。Janwitthayanan等[7]基于全基因組序列獲得細(xì)菌膠原蛋白酶基因，利用RT-PCR方法體外檢測(cè)其表達(dá)量，驗(yàn)證了膠原蛋白酶在肺出血致病菌的存活與致病性方面起重要的作用。交替假單胞菌屬因作為海洋特有菌屬而備受關(guān)注，其基因組數(shù)據(jù)庫(kù)不斷得到擴(kuò)充[8-9]。目前，交替假單胞菌屬基因組中多有膠原蛋白酶這一功能基因的提示，但是相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)是否具有膠原蛋白酶活性未見(jiàn)報(bào)道。作者從Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組草圖出發(fā)[10]，利用基因組發(fā)掘方法獲得膠原蛋白酶基因，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得純化蛋白并檢測(cè)其功能活性，以期驗(yàn)證交替假單胞菌屬中膠原蛋白酶的活性，為該菌屬來(lái)源的膠原蛋白酶的深入研究與潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

海洋細(xì)菌交替假單胞菌（Pseudoalteromonas） NJ631：分離于珍珠膜海綿（Hymeniacidon perleve），由寧波大學(xué)浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌（Escherichia coli）Rosseta（DE3）、質(zhì)粒pET28：Novagen公司；大腸桿菌（Escherichia coli）Top10：Invitrogen公司。

1.2主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（K1071）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（GK2004）：上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖膠DNA回收純化試劑盒（D6492）：Omega公司；DNA Marker、rTaq聚合酶、DNA連接酶：TaKaRa公司；蛋白質(zhì)Marker：碧云天生物技術(shù)研究所；限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindIII：NEB公司；Ni-NTA agarose：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；不溶性Ⅰ型膠原與Ⅰ型膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品：生工生物工程（上海）有限公司；Bio-Rad DC Protein ASSAY試劑盒：Bio-Rad公司；其他試劑：均為分析純?cè)噭?；超濾離心管Amicon Ultra-10：購(gòu)自Millipore公司；純水制備系統(tǒng)：美國(guó)Pall公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Sigma公司；酶標(biāo)儀：Thermo公司；勻漿儀Precellys 24：Bertin公司；PCR儀：杭州博日科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：上海歐翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3主要培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：0.1 g/dL酵母粉，0.5 g/dL蛋白胨，0.01 g/dL檸檬酸鐵，過(guò)濾海水，用于交替假單胞菌NJ631的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基：1 g/dL胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉，用于大腸桿菌Rosseta（DE3）和Top10的培養(yǎng)。

1.4交替假單胞菌NJ631基因組DNA抽提

取1 mL處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Pseudoalteromonassp.NJ631菌液，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取其基因組DNA。

1.5基因組中膠原蛋白酶基因的發(fā)掘

基于基因組第二代測(cè)序技術(shù)獲得的Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組草圖，利用Glimmer3.0基因軟件預(yù)測(cè)得到4658個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frames，ORFs）。經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)，獲得ORF的功能提示[10]，進(jìn)而發(fā)掘潛在的具有膠原蛋白酶功能的編碼基因。將基因編碼的氨基酸序列提交NCBI獲得序列登錄號(hào)，并進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.6膠原蛋白酶基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)膠原蛋白酶基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物：P1：5’-CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3’；P2：5’-CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT -3’，下劃線(xiàn)分別為限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)，引物由Invitrogen公司生產(chǎn)合成。以NJ631基因組為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃5 min；95℃30 s，51℃30 s，72℃90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段。

1.7表達(dá)載體的構(gòu)建

利用限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ和XhoⅠ分別對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET28a和膠原蛋白酶基因進(jìn)行雙酶切，回收的酶切片段經(jīng)DNA T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR檢測(cè)篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，獲得重組質(zhì)粒pET28a-Pnjc。核苷酸序列的測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.8膠原蛋白酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

過(guò)夜培養(yǎng)的重組表達(dá)菌液按1%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到20 mL含卡那霉素（25 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600約為0.6時(shí)，添加IPTG至終濃度分別為0.2、1 mmol/L，于28℃、120 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)4 h。培養(yǎng)基經(jīng)離心后收集菌體，利用buffer A（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，400 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)10%甘油）進(jìn)行重懸。菌體細(xì)胞經(jīng)勻漿儀破碎后離心，分別收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。膠原蛋白酶的純化參考McQuade等方法[11]，獲得的純化蛋白質(zhì)經(jīng)超濾離心管濃縮后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.9膠原蛋白酶活性檢測(cè)

以不溶性Ⅰ型膠原蛋白為底物，采用茚三酮顯色法[12]測(cè)定膠原蛋白酶PNJC水解底物釋放的水溶性氨基酸和短肽。反應(yīng)體系：0.1 mL酶液，0.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（含50 mmol CaCl2，pH 7.5），不溶性I型膠原1 mg。37℃孵育30 min，加入0.6 mL 10%的三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)。反應(yīng)物10 000 r/min離心10 min，取上清液0.6 mL并加入0.6 mL 2 mol/L乙酸緩沖液（pH 5.4）及0.6 mL茚三酮顯色溶液，充分混合后，100℃水浴加熱15 min，冰水冷卻5 min，經(jīng)60%乙醇稀釋后于570 nm處測(cè)定吸光值。以不加目的蛋白質(zhì)作為陰性對(duì)照，膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品作為酶活反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，每組反應(yīng)均重復(fù)3次。以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

酶活力定義為：在37℃，pH值7.5條件下，每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg甘氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

2　結(jié)果與討論

2.1 NJ631基因組中膠原蛋白酶基因的發(fā)掘

根據(jù)ORF的基因功能提示，我們發(fā)現(xiàn)Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組中含有一條完整的膠原蛋白酶編碼基因，命名為Pnjc。該基因全長(zhǎng)1 359 bp，GC含量45.62%，編碼由452個(gè)氨基酸殘基組成的約51 000大小的膠原蛋白酶。經(jīng)Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的膠原蛋白酶PNJC與同屬中的蛋白酶相似性均在85%以上，其中與Pseudoalteromonas piscicida中的蛋白酶相似性最高，達(dá)到99%。

2.2重組表達(dá)載體pET28a-PNJC的構(gòu)建

利用帶有酶切位點(diǎn)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小與交替假單胞菌NJ631中膠原蛋白酶編碼基因Pnjc的序列大小相符，見(jiàn)圖1，表明成功獲得Pnjc基因片段。

圖1　膠原蛋白酶編碼基因Pnjc的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of Pnjc DNA fragment

將Pnjc與表達(dá)載體pET28a分別經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，回收酶切片段。經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌落PCR檢測(cè)，篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子。測(cè)序結(jié)果顯示pET-28a在酶切位點(diǎn)BglⅡ和XhoⅠ之間成功插入Pnjc基因片段且無(wú)突變點(diǎn)。

2.3重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)與重組蛋白純化

以pET-28a為表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)重組蛋白PNJC在大腸桿菌Rosseta（DE3）中得到高效表達(dá)，見(jiàn)圖2。在51 000附近有明顯蛋白質(zhì)條帶，與膠原蛋白酶PNJC大小相符。PNJC在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L時(shí)的表達(dá)量與1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下的表達(dá)量相當(dāng)。細(xì)胞裂解液上清液與沉淀的分析結(jié)果表明，可溶性重組蛋白PNJC表達(dá)顯著。

圖2　重組蛋白PNJC的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 2 Heterogeneous expression of PNJC in Rosseta

將含有重組蛋白PNJC的細(xì)胞裂解上清液上樣Ni-NTA瓊脂糖凝膠純化柱，利用PNJC碳端帶有組氨酸標(biāo)簽對(duì)其進(jìn)行親和層析純化，通過(guò)梯度洗脫獲得純化重組蛋白質(zhì)。SDS-PAGE檢測(cè)表明，成功獲得純化的膠原蛋白酶PNJC，見(jiàn)圖3。經(jīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)顯示純化得到的膠原蛋白酶PNJC蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為1 mg/mL，可進(jìn)行該酶的酶活測(cè)定。

2.4膠原蛋白酶酶活測(cè)定

以不溶性Ⅰ型膠原蛋白為底物，測(cè)定純化得到的膠原蛋白酶PNJC的酶活活性。結(jié)果顯示，相較于Ⅰ型膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品227.51 U/mg的酶活活性，PNJC表現(xiàn)出160.34 U/mg的酶活活性，為標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%，見(jiàn)表1。這意味著Pseudoalteromonas sp. NJ631來(lái)源的膠原蛋白酶PNJC具有一定的研究?jī)r(jià)值與工業(yè)開(kāi)發(fā)潛力。

圖3　重組膠原蛋白酶PNJC的純化Fig. 3 Purified recombinant collagenase PNJC

表1　膠原蛋白酶PNJC的底物活性檢測(cè)Table 1 Enzymatic activity of collagenase PNJC

本研究中Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組中膠原蛋白酶編碼基因Pnjc已提交NCBI，并獲得序列登錄號(hào)：KF439859

3　結(jié)語(yǔ)

膠原蛋白酶的重要應(yīng)用價(jià)值使其備受關(guān)注。本研究首次基于Pseudoalteromonas sp.NJ631基因組草圖，利用基因組信息發(fā)掘方法獲得膠原蛋白酶編碼基因Pnjc，并通過(guò)異源表達(dá)與親和層析純化獲得重組蛋白PNJC。膠原蛋白酶PNJC的酶活力為160.34 U/mg，達(dá)到膠原蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品的70.48%，具有重要的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。異源表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化、重組蛋白純化方法的改進(jìn)、氨基酸位點(diǎn)的突變將有助于我們獲得高質(zhì)量的具有生物活性的重組蛋白PNJC，為首個(gè)交替假單胞菌屬來(lái)源的膠原蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

目前，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄超過(guò)7 000個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)，其中細(xì)菌來(lái)源的基因組數(shù)據(jù)約4 500個(gè)，后基因組時(shí)代已經(jīng)到來(lái)。較真核生物而言，細(xì)菌具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，細(xì)菌豐富的基因資源為潛在的功能蛋白質(zhì)的發(fā)掘與新型化合物的指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)提供了充足的數(shù)據(jù)資源。而基因組信息發(fā)掘方法為如何利用細(xì)菌基因組資源獲得目的基因提供了思路，避免了通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)獲得目的基因的傳統(tǒng)方法[6]，達(dá)到快速篩選、節(jié)約時(shí)間、提高效率的目的。Rainbow等從類(lèi)鼻疽桿菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)掘到一條膠原蛋白酶的編碼基因，通過(guò)基因克隆、異源表達(dá)與酶活檢測(cè)驗(yàn)證了該基因編碼蛋白具有明膠酶與膠原蛋白酶活性[13]。以細(xì)菌基因組為基礎(chǔ)，借助基因組發(fā)掘技術(shù)將有助于我們快速獲得更加高效、工業(yè)化開(kāi)發(fā)潛力的膠原蛋白酶。

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Molecular Cloning and Expression of Collagenase Produce by Marine Bacteria Pseudoalteromonas sp. NJ631

XUE Chunxu1，CHEN Wei2，ZHOU Yufang3，ZHU Peng*1
（1. School of Marine Sciences Ningbo University，Ningbo 315211，China；2. PingYang Ooceanic & Fishery Bureau，Wenzhou 325400，China；3. Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316100，China）

Abstract：The gene encoding collagenase from Pseudoalteromonas sp.NJ631 was cloned and expressed in E.coli cells. Subsequently，the bioactivity of recombinant protein，named PNJC，was assessed. The gene sequence encoding a putative collagenase，designed Pnjc，was obtained from the genome of Pseudoalteromonas sp. NJ631 using a genome mining approach. The Pnjc coding region was amplified and cloned into pET-28a Vector. The plasmids harboring the assembled full-length sequence encoding PNJC were transformed into the E.coli cells for the expression of the PNJC protein. The expression and purification of the recombinant protein were carried on according tobook=181,ebook=74manufacturer's instruction. Finally，the enzymatic activity of collagenase was assessed by using recombinant protein decomposing the type I collagen as substrate. The 1359-bp open reading frame with 45.62% GC was obtained from the genome of Pseudoalteromonas sp. NJ631，which was encoded of a protein of 452 amino acids and shared significant homology with the collagenase from the other genera. The PNJC was highly expressed by adding 0.2 mM IPTG. The assay of enzyme activity showed that the enzyme activity of PNJC was 160.34 U/mg，70.48% of the standard，confirming that the Pnjc gene encoded a functional collagenase. This is the first report of the cloning the expression of collagenase from marine bacteria Pseudoalteromonas sp. The PNJC encoded by Pnjc gene from NJ631 showed high bioactivity on decomposing the type I collagen，which are of potential value for the commercial exploitation.

Keywords：Pseudoalteromonas，collagenase，genome mining，enzymatic activity

*通信作者：朱鵬（1979—），男，山西人長(zhǎng)治人，理學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事海洋微生物研究。E-mail：zhupeng@nbu.edu.cn

基金項(xiàng)目：浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2012C22068）。

收稿日期：2014-05-30

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 819

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0180—05