蘆東徽，于瀚卿，汪　勤，劉加濤，孫國(guó)平

(1.中國(guó)人民解放軍第105醫(yī)院腫瘤四科，安徽 合肥　230031；

2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽 合肥　230022)

?

PKM2在肝癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

蘆東徽1，于瀚卿2，汪勤2，劉加濤2，孫國(guó)平2

(1.中國(guó)人民解放軍第105醫(yī)院腫瘤四科，安徽 合肥230031；

2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽 合肥230022)

摘要：目的探討M2型丙酮酸激酶同工酶(PKM2)在人肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。方法采用免疫組化方法對(duì)手術(shù)確診的144例肝癌及癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行PKM2檢測(cè)，并分析其表達(dá)與臨床病理、生化之間的關(guān)系。結(jié)果肝癌組織中PKM2陽(yáng)性表達(dá)為53.5%，癌旁組織中PKM2陽(yáng)性表達(dá)為27.1%；PKM2的表達(dá)與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、腫瘤大小和分化程度呈顯著相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、肝炎病史、肝硬化病史、甲胎蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及臨床分期無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)KM2在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且其表達(dá)與肝癌的腫瘤大小和分化程度密切相關(guān)，有望成為肝癌診斷的新指標(biāo)及潛在的治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：肝癌；M2型丙酮酸激酶同工酶；免疫組織化學(xué)法

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)在全球惡性腫瘤發(fā)病率中占第六位[1]，第五常見(jiàn)的是男性腫瘤，第七常見(jiàn)的是女性腫瘤[2]，每年新發(fā)病例564 000例，每年的死亡例數(shù)為30～50萬(wàn)[3-4]。在我國(guó)，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率約為(70～80)/10萬(wàn)[5]，腫瘤相關(guān)死亡率僅次于肺癌[6]。甲胎蛋白(AFP)作為肝癌的唯一腫瘤標(biāo)志物，多用于術(shù)后監(jiān)測(cè)和療效評(píng)估，且有一部分病人敏感性不高。M2型丙酮酸激酶同工酶(PKM2)是一個(gè)重要的腫瘤啟動(dòng)和發(fā)展因子，通過(guò)調(diào)控Warburg效應(yīng)影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，在多種腫瘤組織中都有高表達(dá)[7-8]。將PKM2作為新的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估等已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[9-10]，但PKM2與原發(fā)性肝癌的關(guān)系少見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)制作肝癌組織及癌旁組織的組織芯片，采用免疫組化的方法檢測(cè)PKM2在HCC病人肝癌組織及癌旁組織的表達(dá)，探討其與HCC臨床病理、生化特征的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1一般資料144例肝癌組織取自2001—2007年就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌的患者的病理標(biāo)本作為肝癌組織，并取同一標(biāo)本距癌組織邊緣>5 cm且經(jīng)HE染色證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、無(wú)明顯細(xì)胞增生等病變的肝組織作為癌旁組織，制作組織芯片。病理確診依據(jù)參照WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)為：患者于術(shù)前接受過(guò)任何形式的放療和(或)化療。144例病例中，男性119例，女性25例；年齡21～84歲，平均年齡50.93歲，中位年齡50歲；腫瘤大小(癌結(jié)節(jié)直徑)≤5 cm者58例，>5 cm者86例；依據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，高分化44例，中分化61例，低分化39例；依據(jù)UICC/AJCC(2010)分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期3例，Ⅱ期111例，Ⅲ期26例，Ⅳ期4例。

1.2方法與試劑

1.2.1組織芯片的制備根據(jù)芯片微陣列的設(shè)計(jì)，提前制作TMA受體蠟塊待用。病理蠟塊切片經(jīng)HE染色后在光鏡下觀察，選取最適宜的取材部位，使用組織芯片制作機(jī)在供體蠟塊上打孔，孔徑以1～1.5 mm為宜，并將其轉(zhuǎn)移到提前準(zhǔn)備好的受體蠟塊中；依次選取所有標(biāo)本，將構(gòu)建好的芯片蠟塊妥善固定，放入55℃溫箱中加熱10 min后室溫下冷卻，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組化染色組織芯片制作4 μm連續(xù)切片，烤片后二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，檸檬酸鹽微波修復(fù)抗原，3%H2O2避光孵育封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶，10%正常羊血清37℃封閉，PKM2兔抗人單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫后37℃孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照組一抗使用磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2.3主要試劑PKM2兔抗人單克隆抗體購(gòu)自abcam公司(貨號(hào)：ab154816)，稀釋溶度為1∶200；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、酶標(biāo)羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物、DAB 染色液、蘇木素染液等均購(gòu)自中杉金橋公司(貨號(hào)：PV-6000-D)。

1.3結(jié)果判定PKM2染色采用半定量積分方法評(píng)定陽(yáng)性表達(dá)：分別在腫瘤和癌旁組織中隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，依據(jù)視野下染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比聯(lián)合評(píng)分。染色強(qiáng)度：未顯色計(jì)為0分，弱陽(yáng)性顯色(淡黃色)計(jì)為1分，中等陽(yáng)性顯色(棕黃色)計(jì)為2分，強(qiáng)陽(yáng)性顯色(黃褐色)計(jì)為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：未顯色計(jì)為0分，小于25%計(jì)為1分，25%～50%計(jì)為2分，>50%計(jì)為3分。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥3分為陽(yáng)性表達(dá)，<3分為陰性表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析肝癌組織與癌旁組織中PKM2表達(dá)的差異，χ2檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)分析PKM2與各臨床病理特征之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1PKM2在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)PKM2的陽(yáng)性顯色為黃色至棕褐色，主要定位于細(xì)胞漿，詳見(jiàn)圖1。 肝癌組織中PKM2陽(yáng)性表達(dá)有77例(53.5%)，陰性表達(dá)有67例(46.5%)；癌旁組織中PKM2陽(yáng)性表達(dá)有39例(27.1%)，陰性表達(dá)有105例(72.9%)；肝癌組織中PKM2的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.283，P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1　PKM2在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)

圖1PKM2的陽(yáng)性及陰性表達(dá)

注：A：腫瘤組織PKM2陽(yáng)性表達(dá)(×100)；B：腫瘤組織PKM2陽(yáng)性表達(dá)(×400)；C:腫瘤組織PKM2陰性表達(dá)(×100)；D:腫瘤組織PKM2陰性表達(dá)(×400)。

2.2PKM2表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系在肝癌組織中，PKM2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表2。表2數(shù)據(jù)顯示：PLM2的表達(dá)與性別(χ2=0.078，P=0.708)、年齡(χ2=0.009，P=0.923)、肝炎病史(χ2=0.102，P=0.749)、肝硬化病史(χ2=0.323，P=0.570)、甲胎蛋白(AFP)(χ2=0.235，P=0.628)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)(χ2=1.51，P=0.469)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(χ2=3.295，P=0.069)以及臨床分期(Z=-1.012，P=0.312)等臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05)；而與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)(χ2=4.052，P=0.044)、堿性磷酸酶(ALP)(χ2=4.656，P=0.031)、腫瘤大小(χ2=4.197，P=0.041)和分化程度(Z=-4.130，P<0.001)等因素呈顯著相關(guān)(P<0.05)。

表2　PKM2表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

3討論

腫瘤細(xì)胞即使在氧供應(yīng)充足的條件下，仍主要采用產(chǎn)能效率較低的糖酵解方式進(jìn)行葡萄糖代謝，而不是線粒體氧化磷酸化，這一有氧糖酵解代謝模式即Warburg效應(yīng)[11]。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是糖酵解途徑的三個(gè)關(guān)鍵酶之一，主要功能是催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。丙酮酸激酶共有L、R、M1、M2四種同工酶。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解異常活躍與其PKM2高表達(dá)有關(guān)，PKM2高表達(dá)的細(xì)胞惡性度高，生長(zhǎng)速度快，提示PKM2可以通過(guò)增強(qiáng)糖代謝而加速腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，臨床研究也證實(shí)胃、結(jié)腸、腦、肺等多種腫瘤組織均存在PKM2的高表達(dá)[12-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中PKM2陽(yáng)性率為53.5%，而癌旁組織中PKM2陽(yáng)性率僅為27.1%，肝癌組織中PKM2的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.001)，提示PKM2蛋白的表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

本研究對(duì)PKM2表達(dá)與HCC的臨床病理特征進(jìn)行了相關(guān)分析，研究結(jié)果顯示PKM2的表達(dá)和患者的性別、年齡、肝炎和肝硬化病史均無(wú)明顯相關(guān)性。進(jìn)一步分析表明，分化程度與PKM2的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，分化程度越差的患者PKM2表達(dá)越高(低分化表達(dá)率為69.2%，高分化表達(dá)率為25.0%)，可能與腫瘤分化程度越低，增殖越活躍，對(duì)能量需求更高有關(guān)。由此也表明PKM2的高表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性行為有密切聯(lián)系。隨著腫瘤體積的增大，能量需求隨之提高，本研究結(jié)果也顯示PKM2的表達(dá)與腫瘤大小具有相關(guān)性，直徑>5 cm的腫瘤其PKM2表達(dá)明顯高于<5 cm的腫瘤。

γ-GT和ALP廣泛存在于機(jī)體的多種組織中。肝臟中γ-GT由肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生，局限于肝細(xì)胞漿及肝內(nèi)膽管內(nèi)皮細(xì)胞中，從膽道排泄，肝癌細(xì)胞的逆分化猶如胚胎期，使γ-GT增多。ALP由肝細(xì)胞合成分泌至膽道排泄，當(dāng)肝細(xì)胞受損，膽管內(nèi)壓增高，可使肝臟合成增加，膽道排泄減少，血中ALP升高。本研究發(fā)現(xiàn)γ-GT和ALP高的患者PKM2表達(dá)高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示PKM2與肝癌患者肝功能受損的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系。

PKM2的表達(dá)與腫瘤的臨床分期有關(guān)，本研究3例I期患者PKM2表達(dá)均為陰性，而4例IV期患者PKM2表達(dá)均為陽(yáng)性，但由于樣本量太少全組未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，人肝癌組織中的PKM2表達(dá)明顯高于其癌旁組織，且與腫瘤大小和分化程度密切相關(guān)，提示PKM2的表達(dá)在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PKM2有望成為原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)記物和重要的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 [J].International Journal of Cancer,2015,136(5):E359-E386.

[2]Bosetti C,Turati F,La Vecchia C.Hepatocellular carcinoma epidemiology [J].Best Practice & Research Clinical Gastroenterology,2014,28(5):753-770.

[3]Shariff MI,Cox IJ,Gomaa AI,et al.Hepatocellular carcinoma:current trends in worldwide epidemiology，risk factors，diagnosis and therapeutics [J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2009,3(4):353-367.

[4]Yang JD,Roberts LR.Hepatocellular carcinoma:a global view [J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010,7(8):448-458.

[5]Yuen MF,Hou JL ,Chutaputti A.Hepatocellular carcinoma in the Asia pacific region [J].Gastroenterol Hepatol,2009,24(3):346-353.

[6]湯釗猷.從肝癌看癌癥臨床研究 [J].腫瘤,2009,29(1):1-4.

[7]Hacker H,Steinberg P,Bannasch P.Pyruvate kinase isoenzyme shift from L-type to M2-type is a late event in hepatocarcinogenesis induced in rats by a choline-deficient/DL-ethionine-supplemented diet [J].Carcinogenesis,1998,19(1):99-107.

[8]Christofk HR,Vander Heiden MG,Wu N,et al.Pyruvate kinase M2 is a phosphotyrosine-binding protein [J].Nature,2008,452(7184):181-186.

[9]Kwon OH,Kang TW,Kim JH,et al.Pyrurate kinase M2 promotes the growth of gastric cancer cells via regulation of Bcl-xL expression at transcriptional level [J].Bioehem Biophys Commun,2012,423(1):38-44.

[10] Zhou CF,Li XB,Sun H,et al.Pyruvate kinase type M2 is upregulated in colorectal cancer and promotes proliferation and migration of colon cancer cells [J].IUBMB Life,2012,64(9):775-782.

[11] Vander Heiden MG,Cantley LC,Thompson CB.Understanding the Warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation [J].Science,2009,324(5930):1029-1033.

[12] Christolk HR,Vander Heiden MG,Harris MH,et al.The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumour growth [J].Nature,2008,452(7184):230-233.

[13] Jung Y,Jang YJ,Kang MH,et al.Metabolic signature genes associated with susceptibility to pyruvate kinase,muscle type 2 gene ablation in cancer cells [J].Mol Cells,2013,35(4):335-341.

[14] Christofk HR,Vander Herden MG,Wu N,et al.Pyruvate kinase M2 is a phosphotyro-sine-binding protein [J].Nature,2008,45297(184):181-186.

[15] Bluemlein K,Gruning NM,Feichtinger RG,et al.No evidence for a shift in pyruvate kinase PKM1 to PKM2 expression during tumorigenesis [J].Oncotarget,2011,2(5):393-400.

[16] Liu Z,Feng JG,Tuersun A,et al.Proteomic identification of differentially-expressed proteins in esophageal can cer in three ethnic groups in Xinjiang [J].Mol Bio Rep,2011,38(5):3261-3269.

Expression of pyruvate kinase M2 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance

LU Dong-hui1,YU Han-qing2,WANG Qin2,et al

(1.The4thtumorDiagnosisandTreatmentCenter, 105thHospitalofPLA,Hefei,Anhui230031,China.2.DepartmentofOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230022,China)

Abstract:Objective To explore the expression of PKM2 and clinical significance in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods The expression of PKM2 in 144 surgically resected specimens of hepatocellular carcinoma cancer was evaluated by immunohistochemical, and the clinical and pathological features were further analyzed.Results The positive rate for PKM2 expression in hepatocellular carcinoma tissues and paraneoplastic tissues was 53.5% and 27.1%, respectively. The expression of PKM2 was positively correlated with tumor size, pathological grade and the expression of γ-GT and ALP(P<0.05). However, the expression of PKM2 was not correlated with the patients gender, age, hepatitis history, liver cirrhosis, AFP, AST, ALT and clinical stages(P>0.05). ConclusionsThe expression level of PKM2 in HCC tissues is significantly higher than the paraneoplastic tissues, and the expression of PKM2 was correlated with tumor size and pathological grade, suggested that PKM2 may serve as a valuable biomarker for diagnosing and a potential target for treating HCC.

Key words:hepatocellular carcinoma;PKM2;immunohistochemical

(收稿日期：2016-04-18)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.024

通信作者：孫國(guó)平，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤學(xué)，E-mail:sunguoping@ahmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 81572430)