劉　超，王　薇，韓　梅，唐　勇(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊　830054;附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，烏魯木齊　830000)

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m iR-338-3p在胃癌組織中的表達及其意義

劉超1，王薇2，韓梅2，唐勇2
(新疆醫(yī)科大學1第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊830054;2附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，烏魯木齊830000)

摘要:目的探討微小RNA-338-3p(miR-338-3p)在胃癌組織中的差異表達及其表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。方法收集手術(shù)切除的51例胃癌標本及配對癌旁胃組織標本，采用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測miR-338-3p在胃癌組織及配對癌旁胃組織中的表達，并探討其表達與胃癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果與配對癌旁胃組織比較，miR-338-3p在34例胃癌組織中呈低表達，相對表達量為(0．36±0．16)，在17例胃癌組織中呈高表達，相對表達量為(1．71±0．66)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。miR-338-3p的表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)(P均＜0．05)，而與年齡、性別及組織學分級無明顯相關(guān)性(P均＞0．05)。結(jié)論miR-338-3p在胃癌組織中低表達，可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，可能成為胃癌診斷及判斷病情的新方向。

關(guān)鍵詞:胃癌;微小RNA-338-3p;臨床病理特征

盡管在世界范圍內(nèi)胃癌發(fā)病率大大降低，但其仍然是世界四大常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率分別位居第4位、第2位。包括中國在內(nèi)的東亞地區(qū)胃癌的發(fā)病率最高［1－3］，其在中國發(fā)病率僅次于肺癌，位居第2位［4］。目前胃癌的根治方法依然是手術(shù)治療，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示在根治術(shù)后早期胃癌5年生存率可達到90%，進展期胃癌僅僅有30%～40%［5］，由于缺乏有效的早期診斷方法，患者就診時往往處于腫瘤晚期，早已喪失根治性手術(shù)機會。即使通過手術(shù)治療，胃癌病人依然面臨著高復發(fā)、高轉(zhuǎn)移及預后不良的高死亡風險。尋找胃癌早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療及判斷預后的高效指標是提高胃癌患者生存率、提高生活質(zhì)量、降低胃癌患者死亡率的關(guān)鍵所在。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后中起著重要的作用，如前列腺癌［6］、胰腺癌［7］、結(jié)直腸癌［8］、宮頸癌［9］、肺癌［10］以及胃癌［11］等惡性腫瘤。MiR-338-3p是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其可通過調(diào)控腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等參與腫瘤演進過程。目前有關(guān)MiR-338-3p在肝癌及結(jié)直腸癌中的作用多有報道，而有關(guān)其在胃癌中的研究已引起人們的注意。本研究旨在通過實時定量RT-PCR技術(shù)，觀察miR-338-3p在胃癌與配對癌旁胃組織中表達狀況，分析其表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性。

1　材料與方法

1．1材料標本取自新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2012年4月－2013年5月經(jīng)手術(shù)治療的51例胃癌組織標本，同時每份標本均取得遠隔5 cm以上癌旁胃組織作為對照。其中男性35例，女性16例;維吾爾族9例，漢族42例，年齡(57．58±11．06)歲;所取標本均具有完整的相關(guān)病理資料(參照醫(yī)院病理診斷)及臨床資料(根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標準進行臨床分期)。所有胃癌患者術(shù)前均未做放療、化療及其他針對腫瘤的治療。所有標本的使用均符合知情同意原則。組織在術(shù)中離體30 min內(nèi)立即進行標本及配對組織標本的取材，用于后續(xù)RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR實驗，標本采集后快速放至液氮中冷凍，及時放入－80℃低溫冰箱保存。

1．2方法

1．2．1 RNA的提取和鑒定分別取液氮保存的胃癌組織及其配對癌旁胃組織，在液氮中碾碎至粉末狀，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取總RNA(購自美國Invitrogen公司)。用紫外分光光度法檢測提取RNA的純度和濃度，所有標本RNA的OD260/ OD280吸光值均為1．8～2．1，說明提取出的總RNA純度好。瓊脂糖電泳實驗檢測總RNA的完整性。

1．2．2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-338-3p的表達引物設計與合成:自miRNABase數(shù)據(jù)庫(http://microrna．sanger．Ac．Uk/)和Genebank查找基因序列，用Primer-Express2．0軟件進行引物設計。由華大基因科技有限公司根據(jù)miR-338-3p的基因序列5'-UCCAGCAUC-AGUGAUUUUGUUG-3'設計反轉(zhuǎn)錄引物及上下游引物(內(nèi)參照RNU6B上游引物:CUCGCUUCGGCAAGACA，下游引物: AACGCUUCACGAAUUUGCGU;反向通用引物: CAGTGCAGGGTCCGAGGT)。

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，逆轉(zhuǎn)錄過程按照Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒操作說明書進行(購自美國Thermo Scientific公司)。qRTPCR反應體系20μL，包括2×miRcutemiRNA Premix (with SYBR＆ROX)10μL、前向引物0．4μL、反向引物(10μm)0．4μL、滅菌用水7．2μL及cDNA(稀釋比例1∶10)2μL。PCR條件為94℃2 min，94℃12 s，60℃34 s，40個循環(huán)，每個樣本及內(nèi)參進行3次重復，陰性對照以雙蒸水(ddH2O)代替cDNA模板并進行熔解曲線檢測，得到各樣本中目的基因擴增的Ct值(Ct值是熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)數(shù))［5］用于miR-338-3p定量的判定。用RNU6B作為內(nèi)參照。不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄效率，以配對癌旁胃組織△Ct值進行校正，△Ct=Ct標本－CtRNU6B;△△CT=△Ct癌組織－△Ct配對癌旁胃組織，各樣本中miR-338-3p相對含量用2－△△Ct表示，其數(shù)值表示胃癌組相對于配對癌旁胃組的相對倍數(shù)。△△CT值為負值，miR的表達上調(diào)，△△CT值為正值，miR的表達下調(diào)。對PCR熔解曲線進行分析，并用1．5%瓊脂糖凝膠電泳實驗，檢測PCR產(chǎn)物的特異性。

1．3統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)應用SPSS17．0、REST 2009進行分析;計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示。采用t檢驗分析miR-338-3p在胃癌組織及癌旁組織之間的差異表達，采用Pearson線性相關(guān)型分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2．1 m iR-338-3p在胃癌及其配對癌旁組織中的表達51對樣本中可見miR-338-3p cDNA呈現(xiàn)指數(shù)增長，擴增均達到平臺期，Ct值均處于15～35，擴增曲線呈S型擴增(見圖1)，表明擴增效率理想。分析熔解曲線，miR-338-3p對應的Tm值為(76．34±0．14)℃，熔解溫度均一，峰形單一銳利，說明PCR反應的特異性良好，無非特異性擴增、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)(見圖2)。

圖1　miR-338-3p及U6的qPCR擴增曲線

根據(jù)RT-PCR結(jié)果顯示，51例胃癌中，在34例(66．7%)胃癌組織較配對癌旁胃組織中miR-338-3p表達下調(diào)，2－△△CT為(0．36±0．16)和(1．71±0．66)，胃癌組織及對應癌旁正常組織為配對資料，符合正態(tài)性(P=0．20)，配對t檢驗顯示miR-338-3p在胃癌組織中與癌旁正常組織中差異表達具有統(tǒng)計學意義(t=2．48，P=0．016)。REST2009軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示miR-338-3p在胃癌組織較配對癌旁胃組織表達下調(diào)(P=0．028)，差異有統(tǒng)計學意義，與RT-PCR分析結(jié)果一致。

2．3 m iR-338-3p與胃癌臨床病理的相關(guān)性miR-338-3p表達水平與腫瘤的浸潤深度(χ2=3．96，P＜0．05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=10．53，P＜0．05)以及TNM分期(χ2=5．67，P＜0．05)有關(guān)，而與性別、年齡、組織學分級無關(guān)(P＞0．05)(表1)。

圖2　miR-338-3p及U6的qPCR熔解曲線

表1　胃癌組織m iR-338-3p的表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3　討論

miRNAs己被證明在不同基因表達調(diào)控途徑，包括胚胎發(fā)育、細胞凋亡及細胞分裂、分化、死亡，造血作用及癌癥發(fā)生等方面都具有重要作用。目前研究證實超過50%以上的miRNAs基因定位于與腫瘤相關(guān)的基因組脆弱位點［12］，即易發(fā)生斷裂、移位、缺失或重復的區(qū)域，通過對致癌基因和抑癌基因等表達的調(diào)控來參與腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程。近年來較多研究顯示miR-133b、miR-193b、miR-29a、miR-138、miR-125a-5p等在胃癌中低表達，而miR-106a、miR-421、miR-199a-3、miR-21、miR-19a等在胃癌中高表達，miR-27與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)［13］;miR-451的下調(diào)與胃癌預后差相關(guān)［14］;miR-192、miR125與胃癌的增殖及及浸潤程度相關(guān)，而90%的胃癌組織中可發(fā)現(xiàn)miR-21呈高表達狀態(tài)［15］，可用來作為一種診斷性標志物，是胃癌潛在的治療靶標?？梢妋iRNA參與了胃癌從增殖到凋亡的整個過程。

miR-338-3p是近期發(fā)現(xiàn)的定位于染色體17q25．3、由22個核苷酸組成，其序列信息是5'-UCCAGCAUCAGUGAUUUUGUUG-3'，在不同物種間具有高度保守性的單鏈非編碼RNA小分子。由凋亡相關(guān)絡氨酸激酶(AATK)第8內(nèi)含子編碼剪切為成熟的miRNA序列miR-338-3p和miR-338-5p［16］，同其他miRNA類似，miRNA-338-3p通過特異性識別并結(jié)合靶mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated-region，3’UTR)和指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯過程來調(diào)控基因的表達。

3．1 m iR-338-3p在胃癌組織中的表達Li等［17］通過體外細胞系及胃癌組織等研究發(fā)現(xiàn)miR-338-3p在胃癌組織中低表達，miRNA-338-3p可通過減少靶基因SSX2IP的表達而抑制Racl的激活，從而抑制腫瘤細胞的運動、浸潤以及轉(zhuǎn)移，達到抑制腫瘤的目的。Guo等［18］利用實時定量PCR等實驗方法分析53對胃癌及癌旁正常組織，也發(fā)現(xiàn)miRNA-338-3p在胃癌組織中低表達，并證明miRNA-338-3p通過控制P-Rex2a/PTEN/AKT通路來影響胃癌細胞的增殖、浸潤及細胞周期。彭陽等［19］通過研究NRP1在siRNA-NRP1抑制裸鼠胃癌移植瘤中的表達及其對41例人胃癌樣本及24例癌旁正常組織進行分析，同樣發(fā)現(xiàn)miR-338在胃癌組織中低表達，并可通過抑制NRP1的表達來調(diào)控胃癌細胞的增殖、降低胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移程度。本實驗結(jié)果顯示，miR-338-3p在胃癌組織較配對癌旁胃組織表達下調(diào)，提示miR-338-3p可能作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生及演進過程，同相關(guān)實驗結(jié)論相一致。

3．2 m iR-338-3p與臨床病理特征間的關(guān)系miR-338-3p定位于17q25．3，是多種惡性腫瘤的突變“熱點”，其突變后的遺傳表型常與腫瘤的血管侵襲和遠處轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為關(guān)系密切［20］，這種現(xiàn)象提示miR-338-3p可能作為一種“抑癌基因”參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的惡性進程。腫瘤的臨床病理特征及TNM分期是判斷腫瘤惡性程度及預后的主要依據(jù)。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織中的表達量為(3．53±1．81)和(0．40±0．16)，差異有統(tǒng)計學意義，有望為胃癌的早期診斷提供依據(jù);miR-338-3p與胃癌患者的病灶浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期間有顯著相關(guān)性(P＜0．05)，而與胃癌患者的性別、年齡及組織學分級無明顯相關(guān)性?？梢姡琺iR-338-3p不僅影響胃癌的發(fā)生，同樣與胃癌的侵襲、浸潤程度密切相關(guān)。

綜上所述，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-338-3p在胃癌組織中低表達，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，可能是胃癌的一個抑制侵襲轉(zhuǎn)移因子，其表達水平與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期密切相關(guān)，可用來協(xié)助判斷胃癌的預后。為以后miR-338-3p在胃癌中的相關(guān)功能學研究及信號調(diào)控通路研究提供一定的基礎，有望為胃癌靶向治療提供新的靶點。

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(本文編輯楊晨晨)

Expression ofm iR-338-3p in gastric carcinoma and its significance

LIU Chao1，WANG W ei2，HAN M ei2，TANG Yong2
(1Cancer Center，the First Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China;2Department of Gastroenterology，the Affiliated Tumor Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi830000，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the microRNA-338-3p(miR-338-3p)differential expression patterns in gastric carcinoma and adjacent non-tumorous tissues and their relationship with clinicopathological features．M ethods 51 pairs of fresh gastric cancer tissues and corresponding normal gastric epithelium were collected．Quantitative real-time PCR was used to detectmiR-338-3p expression of all the samples．The relationship betweenmiR-338-3p expression and clinicopathological factors of gastric carcinomawas analyzed．Results 34 patientswerewith low expression level ofmiR-338-3p in the 51 patients and 17 patients were with high expression level ofmiR-338-3p (0．39±0．14 vs3．08±1．79，P＜0．05)．The expression levelwas positively correlated to local invasion(P=0．047)，lymph nodemetastasis(P=0．001)and advanced TNM stage(P=0．017)，but not associated significantly with age，gender and differentiation(P＞0．05)．Conclusion The expression level ofmiR-338-3p might be low in patientswith gastric carcinoma，which could be correlated with the generation and development of diseases．Thus，miR-338-3p can be a new direction in diagnosis and predicting the state of gastric carcinoma．

Keywords:gastric carcinoma;MicroRNA-338-3p;clinicopathological features

［收稿日期:2015-07-31］

通信作者:唐勇，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，研究方向:消化道腫瘤的防治與研究，E-mail:ae717ty@163．com。

作者簡介:劉超(1988－)，女，碩士，研究方向:消化道腫瘤的防治與研究。

基金項目:新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(2013211A067)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．011

中圖分類號:R365

文獻標識碼:A

文章編號:1009-5551(2016)03-0308-04