胡奇杰，朱佳茜，王新財(cái)，顧寬宇　(湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江湖州 313000)

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鐵皮石斛飲片中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法的研究

胡奇杰，朱佳茜，王新財(cái)，顧寬宇(湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江湖州 313000)

摘要[目的]制定一套成熟的鐵皮石斛藥材中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法。[方法]在空白鐵皮石斛中加入27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯標(biāo)品，用水浸潤(rùn)樣品，以丙酮和正己烷作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和弗羅里硅土、Carb-NH2柱固相萃取聯(lián)用作為凈化方式，用GC-μECD檢測(cè)農(nóng)藥殘留。[結(jié)果]試驗(yàn)得出，建立的分析方法對(duì)各個(gè)農(nóng)藥的回收率在79.6%～103.1%，重復(fù)性在1.98%～8.26%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。[結(jié)論]研究可為中藥材中農(nóng)藥的殘留檢測(cè)方法的制定和完善提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞鐵皮石斛；有機(jī)氯及擬除蟲菊酯；凝膠凈化

農(nóng)藥多殘留(Pesticide Residues)是指使用農(nóng)藥之后一定時(shí)期內(nèi)沒有被分/降解而殘留于生物體內(nèi)、土壤、水體、大氣中的農(nóng)藥原體、降解物和有毒代謝物及雜質(zhì)的總稱。人們食用了被污染的中草藥后，殘留在其中的農(nóng)藥便會(huì)積聚在體內(nèi)，因其代謝緩慢，最終將導(dǎo)致急性或慢性中毒，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。因此世界各國(guó)對(duì)此高度重視，歐美等許多國(guó)家都對(duì)傳統(tǒng)藥和草藥制定了非常嚴(yán)格的農(nóng)藥多殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)藥多殘留檢測(cè)屬于復(fù)雜混合物中痕量組分分析技術(shù)，中藥材農(nóng)藥多殘留檢測(cè)具有以下特點(diǎn)：既需要精細(xì)的微量操作手段，又需要高靈敏度的痕量檢測(cè)技術(shù)[1]。農(nóng)藥多殘留量檢測(cè)方法的研究已成為影響中藥國(guó)際貿(mào)易的最重要技術(shù)要求之一，嚴(yán)重制約了中藥發(fā)展的國(guó)際化與現(xiàn)代化。因此，研制簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，并可同時(shí)定性、定量的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法是保障人民用藥安全，推動(dòng)中藥材現(xiàn)代化建設(shè)迫切需要解決的問題之一。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。試驗(yàn)采用的鐵皮石斛，采購(gòu)自湖州仁皇山街道康龍保健食品商行。所用水為經(jīng)過二次蒸餾的重蒸水；丙酮、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，均為色譜純，默克公司；27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；無水硫酸鈉，分析純，麥克林。

1.1.2主要儀器設(shè)備。GC-μECD(Agilent7890B)；凝膠凈化系統(tǒng)GPC、全自動(dòng)固相萃取儀，萊伯泰科(LAB TECH)公司；高速勻漿機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA；氮吹儀，美國(guó)Organomation；恒溫水浴振蕩器，上海精風(fēng)儀器有限公司；旋渦混勻器(IKAM S1)；高速冷凍離心機(jī)，貝克曼。

1.2方法

1.2.1樣品處理。提?。悍Q取2 g鐵皮石斛過篩粉末于均質(zhì)杯中，加入6 mL水，充分膨脹，然后加入10 mL丙酮和10 mL正己烷，15 000 r/min均質(zhì)1 min，離心，然后再用5 mL丙酮和10 mL正己烷均質(zhì)2次，合并上清液于加有10 mL飽和氯化鈉溶液的具塞量筒中，劇烈振蕩2 min，靜置20 min，分層。

GPC凈化：吸取上層有機(jī)相過無水硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL，轉(zhuǎn)移至玻璃管氮吹至近干，加6 mL乙酸乙酯+環(huán)己烷(1∶1)溶解。樣品過濾至GPC進(jìn)行凈化，收集9.5～17.5 min流出液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL，轉(zhuǎn)移至玻璃管氮吹至近干，加入2 mL丙酮。

SPE凈化：預(yù)先用5 mL丙酮+二氯甲烷(1+1)活化Carb-NH2柱，加入待凈化液使其逐滴留下，用5 mL×2丙酮+二氯甲烷(1+1)洗脫，收集洗脫液氮吹至近干，加入2 mL正己烷。將弗羅里硅土柱依次用5 mL丙酮+正己烷(1+9)、5 mL正己烷預(yù)淋洗，加入上述待凈化，用5 mL×2丙酮+正己烷(1+9)洗脫，收集洗脫液氮?dú)獯抵两?，用正己烷定容? mL。

1.2.2GC色譜條件。色譜柱：安捷倫DB-1701(30 m×0.25 mm× 0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測(cè)器溫度：320 ℃；柱溫程序升溫：150 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至270 ℃，保持23 min；柱流速：1 mL/min；不分流進(jìn)樣；載氣：氮?dú)?，純度?9.999%[2]。

2結(jié)果與分析

2.1提取過程加水的考察該試驗(yàn)考察樣品在提取前加不加適量的水來考察提取效果，發(fā)現(xiàn)水浸潤(rùn)后提取液澄清透明，因?yàn)榧尤脒m量的水能增加粉狀樣品之間的吸附力，經(jīng)過離心后能完全達(dá)到固液分離。不加水，提取后提取液渾濁，并且有粉末和纖維漂浮在上面，從而影響后續(xù)的試驗(yàn)。并且加了水能使提取溶劑更好地浸入樣品中，從而有利于農(nóng)藥殘留的提取[3]。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不加水各個(gè)農(nóng)藥回收率為38.2%～87.3%，而加水回收率提升到了78.6%～101.8%。因此，在有機(jī)溶劑提取樣品前應(yīng)先加入適量的水浸潤(rùn)。

2.2提取溶劑的選擇樣品前處理的提取方法是影響到整個(gè)試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素，選擇提取溶解有2個(gè)關(guān)鍵因素：第一是將痕量農(nóng)藥殘留完全從樣品中提取出來，第二是盡量少地溶解出雜質(zhì)。根據(jù)有機(jī)氯及擬除蟲菊酯的理化性質(zhì)和相似相溶原理，該試驗(yàn)選擇乙腈、丙酮、正己烷、丙酮+正己烷4種提取溶劑考察提取效果。

通過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除正己烷外其他3種溶劑提取能力相差不多，都能充分提取出農(nóng)藥殘留，但乙腈具有微毒性，并且沸點(diǎn)高，濃縮困難。丙酮雖然滲透性強(qiáng)，但是對(duì)于色素、黃酮、酯類等一些物質(zhì)也有很強(qiáng)的溶解性，在提取過程中也同時(shí)提取出大量的雜質(zhì)，不易凈化。因此，不考慮乙腈和丙酮作為單獨(dú)提取溶劑[4]。

正己烷雖然對(duì)于色素溶解性差，但是不能充分滲透到樣品內(nèi)部，且不能與水相溶，使得提取效率低，27種有機(jī)氯回收率在24.3%～58.1%，因此結(jié)合丙酮一起使用，既能充分地滲入樣品，也能相對(duì)較少地提取出其他的雜質(zhì)，在滿足提取效果的前提下，也為后續(xù)的凈化打下基礎(chǔ)。

2.3提取方式的選擇中藥材基質(zhì)復(fù)雜，提取難滲透，選用適宜的提取方法，能讓提取溶劑與鐵皮石斛基質(zhì)充分接觸、滲透。該試驗(yàn)選用振蕩提取、超聲波提取和高速均漿提取3種方法考察，發(fā)現(xiàn)振蕩提取效果較差，超聲波提取其次，高速勻漿法提取效果最好(表1)。

樣品中加入的提取溶劑的量對(duì)于振蕩提取影響比較大。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取溶劑加入量越大，提取的回收率越高，但是隨著提取溶劑增加，回收率提升的幅度越來越小。加入少量的溶劑，在振蕩提取中不能充分與樣品內(nèi)部接觸，從而導(dǎo)致提取不充分，但是大量地增加溶劑會(huì)相應(yīng)地增加成本，并且振蕩提取的時(shí)間也相對(duì)比較長(zhǎng)。

超聲波提取也是農(nóng)藥殘留常見的提取方法，但是在提取過程中，超聲波內(nèi)部水溫會(huì)隨著提取時(shí)間增長(zhǎng)而升高，而部分農(nóng)藥殘留具有熱不穩(wěn)定性及揮發(fā)性，因此造成了部分農(nóng)藥殘留回收率低下。并且，在整個(gè)超聲容器中超聲波場(chǎng)的分布是不均勻的，類似在波場(chǎng)的分布中有死角，這會(huì)使得部分樣品的提取效率顯著下降，從而導(dǎo)致重現(xiàn)性較差。

使用高速均漿法能在較短時(shí)間內(nèi)，用較少的溶劑得到較好的回收率，并且重現(xiàn)性也較好。高速均漿是樣品在高速攪拌下從攪拌縫隙高速噴出，高壓高速情況下使得鐵皮石斛的粉末進(jìn)一步被破壞細(xì)化，從而使提取溶劑與鐵皮石斛粉末充分接觸，提高了提取效率，并且提取時(shí)間也進(jìn)一步縮短。

該試驗(yàn)也考察了超聲波與振蕩聯(lián)用、超聲波與均漿聯(lián)用、振蕩與均質(zhì)聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)超聲波與振蕩聯(lián)用回收率有了提高，但是還沒有達(dá)到試驗(yàn)要求。后面兩者回收率與單獨(dú)使用均漿法相差不多，因此選用高速勻漿法作為該試驗(yàn)的提取方法。

2.4GPC凈化條件的選擇凈化是利用農(nóng)藥殘留與基體干擾雜質(zhì)理化性質(zhì)的差異，將雜質(zhì)含量減少到能正常檢測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥的殘留水平。GPC可以根據(jù)化合物各個(gè)分子的大小來實(shí)現(xiàn)分離，分子越大通過凝膠色譜柱的速度越快。由于鐵皮石斛中含有大量的色素、多糖類大分子物質(zhì)，單純地用SPE不能完全除去樣品中的雜質(zhì)，因此可以用GPC來初步凈化提取的樣品，盡可能多地除去色素、多糖類雜質(zhì)[5]。

將濃度為0.5 μg/mL的27種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)注入GPC，以環(huán)己烷+乙酸乙酯(1+1)為流動(dòng)相，流速為5 mL/min，通過紫外在線圖譜(圖1)，發(fā)現(xiàn)這些農(nóng)藥在9.5～17.5 min通過凝膠柱進(jìn)入檢測(cè)器。因此選擇9.5～17.5 min作為GPC凈化收集時(shí)間。

2.5SPE凈化柱的選擇通過GPC收集的流出液，發(fā)現(xiàn)還是有些顏色，說明有些色素等雜質(zhì)跟隨農(nóng)藥同時(shí)被洗脫收集。通過氣相色譜的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)干擾目標(biāo)峰的現(xiàn)象還是比較嚴(yán)重，因此選擇固相萃取(SPE)來凈化收集液，SPE是目前農(nóng)藥殘留應(yīng)用中最廣泛、效果也是比較好的方法[6]。

該試驗(yàn)選擇Carb-NH2柱、弗羅里硅土柱、C18柱和氨基柱(表2)，發(fā)現(xiàn)通過C18柱和氨基柱的凈化，樣品中還是有很多雜質(zhì)，使有些目標(biāo)農(nóng)殘被干擾或者覆蓋，可能這兩款柱子不能有效地吸附色素，從而不能達(dá)到理想的凈化效果。而Carb-NH2柱能有效去除樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素和糖類雜質(zhì)，弗羅里硅土柱能用于從非水溶液中吸附低極性以及中等極性化合物，有機(jī)氯及擬除蟲菊酯一般都是非極性或低極性的物質(zhì)，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Carb-NH2柱和弗羅里硅土柱除雜效果較好，但還是有一些干擾雜質(zhì)的存在。

通過Carb-NH2柱和弗羅里硅土柱聯(lián)合使用，凈化效果非常理想。先通過Carb-NH2柱除去樣品中的色素、糖類及有機(jī)酸物質(zhì)，然后再用弗羅里硅土柱進(jìn)一步除去一些極性的雜質(zhì)，并且回收率也達(dá)到農(nóng)藥殘留的要求，因此選用雙柱聯(lián)用的凈化方式。

2.6前處理方法學(xué)考證樣品中加入分成3組的27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收、檢出限及重復(fù)性試驗(yàn)[7]。3組有機(jī)氯及擬除蟲菊酯空白樣品加標(biāo)濃度為0.05 mg/kg的色譜圖見圖2。精密稱取鐵皮石斛樣品30份，各個(gè)農(nóng)藥加標(biāo)濃度為0.05 mg/kg和0.50 mg/kg 2個(gè)添加水平，重復(fù)試驗(yàn)5次，通過GC-μECD檢測(cè)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各個(gè)農(nóng)藥的回收率在79.6%～103.1%，重復(fù)性在1.98%～8.26%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求(表3)。

表2不同SPE對(duì)樣品的凈化效果及回收率

Table 2Effects of SPE on purification and recovery rate of sample

3結(jié)論

該試驗(yàn)建立了27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯在中藥飲片鐵皮石斛中的GC-μECD的前處理方法：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件，用水浸潤(rùn)樣品，以丙酮和正己烷作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和弗羅里硅土、Carb-NH2柱固相萃取聯(lián)用作為凈化方式。該方法既可有效提取鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留，又可完全去除雜質(zhì)干擾，簡(jiǎn)便、省時(shí)、結(jié)果準(zhǔn)確。所建立的分析方法對(duì)各個(gè)農(nóng)藥的回收率在79.6%～103.1%，重復(fù)性在1.98%～8.26%，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求，可推廣應(yīng)用于中藥材中農(nóng)藥的殘留檢測(cè)。

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Detection Method of Organochlorine and Pyrethroid Pesticide Residue inDendrobiumofficinaleSlices

HU Qi-jie, ZHU Jia-xi, WANG Xin-cai et al

(Huzhou Institute for Food and Drug Control, Huzhou, Zhejiang 313000)

Key wordsDendrobiumofficinale; Organochlorine and pyrethroid; Gel purification

Abstract[Objective] To establish a mature detection method for organochlorine and pyrethroid pesticide residue inDendrobiumofficinaleslices. [Method] Standard substances of 27 organochlorines and pyrethroid were added intoD.officinale. After soaked in water, acetone and n-hexane were used as extraction solvent. With high-speed homogenate as the extraction means, GPC was combined with Florida silica and Carb-NH2column solid-phase extraction to purify the substances. [Result]GC-μECD detection found out that the recovery rate of each pesticide was 79.6%-103.1% with repeatability being 1.98%-8.26%, which met the requirements of the pesticide residue detection. [Conclusion] This research provides references for the establishment and improvement of pesticide residue detection method in Chinese Herbal Medicines.

基金項(xiàng)目浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2014C32088)。

作者簡(jiǎn)介胡奇杰(1980- )，男，浙江湖州人，高級(jí)工程師，碩士，從事食品科學(xué)研究。

收稿日期2016-01-26

中圖分類號(hào)S 481+.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-066-04