張怡清　楊園園　丁淑琴

摘要：目的 應(yīng)用生物信息學分析軟件預測結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與功能。方法 應(yīng)用NCBI、Expasy等在線生物信息學網(wǎng)站及DNAstar、Rasmol等軟件包分析38kDa蛋白與其他物種的同源序列，進行多序列同源比對；預測二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)；預測主要抗原表位等。結(jié)果 同源性比對結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白結(jié)核分枝桿菌磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白同源性達87%；預測該蛋白的分子質(zhì)量單位為39113.47 Da，理論等電點為11.779；該蛋白跨膜區(qū)有2個，分別為7-23，7-105，其結(jié)構(gòu)域5個分別位于8-22、35-47、48-79、214-232、233-286。結(jié)論 生物信息學技術(shù)在結(jié)核分支桿菌38kDa蛋白研究中有一定的理論和應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；38kDa；生物信息學；結(jié)構(gòu)；功能

Bioinformatics Analysis for the Structure and Fuction of 38kDa Protein of Mycobacterium Tuberculosis

ZHANG Yi-qing1，YANG Yuan-yuan2，DING Shu-qin1

（1.Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China；2.The First People's Hospital of Yinchuan，Yinchuan 750001，Ningxia，China）

Abstract：Objective To predict the structure and function of recombinant 38kDa of Mycobacterium tuberculosis using bioinformatics method . Methods By online analysis at bioinformatics websites such as NCBI and Expasy ，employing software packages such as DNAstar and Rasmolto do multi-sequence homological alignment， secondary structure and tertiary structure，antigenic epitope analysis，etc. Results Similarity of 38kDa of Mycobacterium tuberculos compared to phosphate-binding protein of Mycobacterium tuberculosis was 87% . Analysis of the predicted protein indicated a molecular mass of 39113.47 Da， PI was 11.779 ， two transmembrane region， function sites and eight antigen epitope were found . Conclusion Bioinformatic is valuable to the study 38kDa 6 ofMycobacterium tuberculosis.

Key words：Mycobacterium tuberculosis ； 38kDa ； Bioinformatics；Structure and fuction

結(jié)核病是全球衛(wèi)生問題之一。2012年WHO的數(shù)據(jù)顯示，全世界約有860萬人罹患結(jié)核病，130萬人死于結(jié)核病[1]。中國是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一，衛(wèi)計委已將結(jié)核病列為全國重點控制重大疾病之一。及時有效的診斷對結(jié)核病的防治具有重要的意義。結(jié)核分枝桿菌診斷抗原的篩選是目前研究的熱點。

38kDa 蛋白又名pab，是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，是MTB分泌較多的抗原。研究表明其屬于分泌蛋白，結(jié)核病患者體內(nèi)抗38kDa 蛋白抗體水平較高[2]。38KDa 蛋白廣泛用于結(jié)核病的血清學診斷試驗，檢測的敏感性和特異性均較高。有關(guān)報道38kDa 的診斷特異度在88%～100%之間，痰涂片陽性患者診斷靈敏度36%～89%，痰涂片陰性患者靈敏度16%～54%、肺外結(jié)核診斷靈敏度12%～56%[3]。Wu X[4]的研究成果表明：38KDa 蛋白診斷結(jié)核病的敏感性為73.6%，特異性為85.4%，并且發(fā)現(xiàn)PPD 陽性血清中的抗38KDa 抗體水平高于PPD 陰性。國內(nèi)張萍等[5]研究重組38KDa 蛋白用于結(jié)核病血清學診斷，發(fā)現(xiàn)重組38KDa蛋白檢測結(jié)核病的敏感性為65.5%，特異性為98.4%，且與痰檢陽性的一致率為69.8%。38KDa 蛋白有較好的應(yīng)用前景，重組38KDa 蛋白作為結(jié)核病皮試診斷試劑，其敏感性和特異性都優(yōu)于目前的結(jié)核菌素試驗。然而有關(guān)38KDa蛋白的基本理化特性、二級結(jié)構(gòu)等的研究報道很少。本研究擬先對其進行生物信息學預測分析，為后續(xù)更好的的實驗研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白全長基因序列源自GenBank（Sequence ID： lcl|4289）。

1.2方法 通過NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），進入blast 界面，進行核酸和蛋白質(zhì)的同源性比較。利用Prot Param（http：//ca.expasy.org/tools/protparam/html）預測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。通過PredictProtein （http： cubic.bioc. columbia. edu/predi ctprotein/）預測氨基酸序列的跨膜區(qū)，用DNAstar軟件預測其二級結(jié)構(gòu)。通過SMART（http： //smart. embl-heidelberg.de/smart/show-motifs.pl）預測其結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果

2.1氨基酸序列及理化特性預測 38kDa基因序列由1124個bp組成，編碼368個氨基酸，其中50 個堿性氨基酸（K，R），13個酸性氨基酸 （D，E），112 個疏水性氨基酸 （A，I，L，F(xiàn)，W，V），106個 極性氨基酸（N，C，Q，S，T，，Y）。該蛋白的分子質(zhì)量單位為39113.47 Da，理論等電點為11.779，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）百分比為15.6%，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）百分比為17.2%，在哺乳動物體外的半衰期為100h，在酵母、大腸埃希菌中的半衰期分別大于20h和10h，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為60.32，脂溶性指數(shù)為62.72，兩親性指數(shù)為-0.436。

2.2氨基酸序列的同源性分析 如圖1所示，38kDa基因氨基酸序列與結(jié)核分枝桿菌磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（Sequence ID： ref|WP_052645811.1|）同源性達87%。

圖1 38kDa基因氨基酸序列的同源性分析

2.3二級結(jié)構(gòu)預測 如圖2所示，經(jīng)DNAstar軟件預測，38KDa蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占21%，β-片層占17%，轉(zhuǎn)角占51%，無規(guī)則卷曲占11%。

圖2 38kDa蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

2.4跨膜區(qū)域、結(jié)構(gòu)域預測 跨膜區(qū)域如圖3所示，該蛋白跨膜區(qū)有2個，分別為7-23，7-105，該蛋白主要位于細胞外，說明其為分泌性蛋白。SMART預測結(jié)果顯示該蛋白的結(jié)構(gòu)域有5個，分別位于8-22、35-47、48-79、214-232、233-286。

圖3 38kDa蛋白跨膜區(qū)域預測

2.5信號肽預測 如圖4所示，經(jīng)Signal法預測顯示38kDa蛋白的信號肽長為20個氨基酸殘基，具體位于1-20，剪切位點位于20-21氨基酸殘基之間。

圖4 38 kDa蛋白信號肽預測

3 討論

隨著近年來生物學分子信息的發(fā)展，用較低的成本和較快的時間，通過計算機模擬相關(guān)的輔助信息可以獲得大量的結(jié)構(gòu)和功能信息。本研究中根據(jù)對38kDa蛋白氨基酸序列及理化特性預測，我們得知38kDa基因序列由1124個bp組成，編碼368個氨基酸，其中50 個堿性氨基酸（K，R），13個酸性氨基酸 （D，E），112 個疏水性氨基酸 （A，I，L，F(xiàn)，W，V），106個 極性氨基酸（N，C，Q，S，T，，Y）。該蛋白的分子質(zhì)量單位為39113.47 Da，理論等電點為11.779，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）百分比為15.6%，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）百分比為17.2%，在哺乳動物體外的半衰期為100h，在酵母、大腸埃希菌中的半衰期分別大于20h和10h，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為60.32，脂溶性指數(shù)為62.72，兩親性指數(shù)為-0.436。氨基酸同源性比對發(fā)現(xiàn)其基因序列與Genbank公共數(shù)據(jù)庫檢索出的與結(jié)核分枝桿菌磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白同源性達87%，說明結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白與磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白有很高的同源性，但二者仍有差別[6]。經(jīng)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析， 該蛋白序列中α-螺旋占21%，β-片層占17%，轉(zhuǎn)角占51%，無規(guī)則卷曲占11%。該蛋白跨膜區(qū)有2個，分別為7-23，7-105，該蛋白主要位于細胞外，說明其為分泌性蛋白。SMART預測結(jié)果顯示該蛋白的結(jié)構(gòu)域有5個，分別位于8-22、35-47、48-79、214-232、233-286。信號肽是一段連續(xù)的氨基酸序列，它能夠控制蛋白質(zhì)分泌路徑和引導蛋白質(zhì)到達特定的組織細胞[7]。研究信號肽問題對于了解蛋白質(zhì)功能、研究疾病機理以及研制新藥物等方面都有著重要的作用。本實驗我們經(jīng)Signal法預測結(jié)果顯示38kDa蛋白的信號肽長為20個氨基酸殘基，具體位于1～20，剪切位點位于20-21氨基酸殘基之間。

本研究我們通過生物信息學原理對結(jié)核分枝桿菌38 kDa蛋白有了初步的了解和認識，至于該蛋白的獲得及其在結(jié)核病診斷及治療中的價值究竟有多大？還需后續(xù)的實驗研究加以證實。

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編輯/哈濤