焦淑珍 張正言 王林 徐盼 李琴琴 賈秋娥

摘 要 二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在花色的修飾中起重要作用，目前，已從多種植物中分離得到。從DFR基因的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制、底物特異性、時(shí)空表達(dá)模式及花色修飾等方面進(jìn)行了概括和總結(jié)，為DFR基因的進(jìn)一步研究和利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 二氫黃酮醇-4-還原酶；花青素；基因工程；調(diào)控機(jī)制

中圖分類號(hào)：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.110

花色是評(píng)定觀賞植物品質(zhì)最重要的因素之一，對(duì)于花卉商品性和價(jià)值性起著決定性的作用。花色主要由類黃酮，類胡蘿卜素，甜菜色素三種類型的色素組成[1，2]。類黃酮中的花青素是影響花色的主要色素，賦予花和果實(shí)從橘色到藍(lán)色的所有顏色，如紅色、粉色、藍(lán)色和紫羅蘭色等[3-5]。二氫黃酮醇4-還原酶（Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR）是花青素代謝生化合成中的關(guān)鍵酶，是決定植物花色和果色從無(wú)色到有色的重要控制點(diǎn)，決定植物的花、果實(shí)、葉片等器官的著色[6]。因此，研究DFR基因的作用機(jī)理對(duì)于花色形成分子機(jī)制有重大意義。

1 DFR基因的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

二氫黃酮醇4–還原酶（DFR）是花色素苷生物合成途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，屬于NADPH 依賴性短鏈還原酶家族或者是DFR亞家族，是單基因編碼。這個(gè)亞家族的成員由肉桂酸、氧化還原酶為代表。它們都含有一個(gè)高度保守的NADPH（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽）結(jié)合位點(diǎn)“VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY”和一個(gè)由“TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV”組成的底物特異性結(jié)合區(qū)。此區(qū)域中第134位氨基酸和第145位的氨基酸會(huì)直接決定底物的特異性，并且在不同植物中相對(duì)保守[7]。DFR用NADPH作為輔因子催化二氫黃酮醇減少，從而生成相應(yīng)的白花色素，這些無(wú)色花色素是花青素和原花青素的前體物。

在花青素合成途徑中，DFR決定花青素苷最終的顏色，是花青素生物合成途徑的關(guān)鍵酶（見(jiàn)圖1）。分別催化二氫山奈酚（Dihydrokaempferol，DHK）、二氫槲皮素（Dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DHM）生成無(wú)色花葵素（Leucopelargonidin）、無(wú)色花青素（Leucocyanidin）和無(wú)色翠雀素（Leucodelphinidin），無(wú)色的DHK、DHQ和DHM進(jìn)一步在DFR 的催化下將上述產(chǎn)物還原成不穩(wěn)定的無(wú)色花色素（Leucoanthocyanidin） [8，9]。

2 DFR基因的分離

1985年，O Reilly等從玉米和金魚(yú)草中利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法將DFR分離出來(lái) 。隨后，在1989年，Beld等又以金魚(yú)草DFR表型突變基因?yàn)樘结樂(lè)蛛x了矮牽牛DFR基因。現(xiàn)已從擬南芥、非洲菊、玫瑰、蘭花、百合、水稻、葡萄、紫色甘薯和草莓等植物中分別分離了DFR基因。Nakatsuka A.等對(duì)雜種百合花CHI和DFR基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：LhDFR基因僅在花色素苷著色組織中表達(dá)，并且調(diào)控花器官的顯色模式。

3 DFR基因的底物特異性

由于DFR對(duì)底物的特異性和表達(dá)水平不同，使植物呈現(xiàn)出不同的花色和果色。DFR可以催化三種無(wú)色的二氫黃酮醇底物，這三種無(wú)色的二氫黃酮醇底物為DHK、DHQ、DHM，形成無(wú)色花青素。三種DFR的底物的結(jié)由于B苯環(huán)羥基數(shù)不同底物親和性有差別。例如，矮牽牛中DFR優(yōu)先催化DHM，生成無(wú)色花翠素，其次催化DHQ，然而對(duì)DHK沒(méi)有轉(zhuǎn)化作用，因此，自然界中缺乏橙色的矮牽牛品系[10]；非洲菊中，DFR能同時(shí)催化DHK、DHQ、DHM三種底物，因此非洲菊中存在天竺葵色素；蘭花中，DFR能有效的催化DHQ和DHM，但是卻不能利用DHK。DFR第134位的氨基酸殘基直接決定底物的特異性。對(duì)蔓越橘的研究表明，第134位氨基酸殘基突變后，就會(huì)改變 DFR 的作用底物。

4 DFR基因的時(shí)空表達(dá)特性

不同植物中的DFR基因，在不同發(fā)育期和不同組織中時(shí)空表達(dá)特性有所不同。研究表明，矮牽牛中的3個(gè)DFR基因（DFRA、DFRB、DFRC），DFRA在花冠、花藥和種子中高表達(dá)，在胚珠和莖中低表達(dá)[11]裂葉牽牛突變株DFR-B（J）基因由于含有轉(zhuǎn)座因子Tpn1，此因子從DFR-B中去除后會(huì)引起體細(xì)胞突變，因而造成花色的多樣性；亞洲百合的2個(gè)品種中，DFR基因在粉紅色被片帶有斑點(diǎn)的“Montreux”植株的花被片、花藥、花絲、雌蕊和紅色的鱗片中大量表達(dá)，然而在黃色被片無(wú)斑點(diǎn)的“Connecticut King”植株中僅在著色的在花藥和鱗片中表達(dá)，此外兩個(gè)植株的葉子、莖、鱗片中沒(méi)有檢測(cè)到DFR的表達(dá)，可見(jiàn)DFR基因僅在花器官著色的部位表達(dá)，且隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)量增加，開(kāi)花期達(dá)到最高。百脈根中存在著5個(gè)DFR基因，能產(chǎn)生不同的功能。結(jié)果表明，百脈根中DFR1在根、莖、葉、花、果實(shí)及豆莢等所有器官中均有表達(dá)，DFR2在除了葉的其他的器官中進(jìn)行表達(dá)，而DFR3主要在葉片和莖中表達(dá)，DFR4和DFR5在根中微量表達(dá)[9]。這些研究結(jié)果表明，DFR基因表達(dá)量與花青素積累呈正相關(guān)，說(shuō)明DFR催化反應(yīng)是花青素合成中的重要步驟，對(duì)該基因的轉(zhuǎn)基因遺傳操作具有重要意義。

5 DFR與花色修飾

DFR是花色素苷生化合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在花色的修飾中起重要作用，了解其轉(zhuǎn)基因的研究不僅能更深一步了解DFR的功能，更有助于利用新方法，如調(diào)入新基因、RNA干擾等實(shí)現(xiàn)花色的修飾。世界上第一例利用基因工程手段改變花色的實(shí)例實(shí)Meyer等于1987 年將玉米DFR 基因?qū)氚珷颗C01突變體，從而提供了天竺葵色素生物合成的中間產(chǎn)物，其花色由白色變?yōu)榈u紅色。1995年，Tanaka等[12]將玫瑰花瓣中克隆得到的DFR基因，利用分子生物學(xué)手段轉(zhuǎn)入淡粉紅色的矮牽牛中，從而產(chǎn)生了橙色矮牽牛。2000年，Aida[13，14]等將反義DFR基因?qū)胨{(lán)豬耳中，結(jié)果轉(zhuǎn)基因株系的花冠花色素苷含量均有不同程度的減少，因此產(chǎn)生了多種新型圖案。由于藍(lán)豬耳轉(zhuǎn)化植株中 DFR基因鈍化，造成大量黃酮和黃酮醇的積累，導(dǎo)致藍(lán)豬耳的花色顯得更藍(lán)。RNAi技術(shù)可以將某些特定基因特異性剔除或關(guān)閉，因此該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能的研究領(lǐng)域，尤其作為一種有效修飾花色的方法被應(yīng)用到了觀賞植物的呈色調(diào)控中[15]。2004年，F(xiàn)ukusaki等利用RNA干擾（RNAi），用CHS mRNA的編碼區(qū)作為RNAi的靶點(diǎn)從而特異誘導(dǎo)基因沉默，最終致使花色由藍(lán)色變?yōu)榘咨虻４送?，控制羥基化模式，也能獲得表達(dá)翠雀素型花青素的轉(zhuǎn)基因康乃馨和玫瑰，現(xiàn)已被商業(yè)化生產(chǎn)[4，16，17]

6 展望

花色是花卉植物觀賞價(jià)值的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一，尤其是罕見(jiàn)的藍(lán)色花，具有極高的科研、生態(tài)和觀賞價(jià)值，一直是花卉育種工作者的終極目標(biāo)之一。傳統(tǒng)的育種方法已不能實(shí)現(xiàn)花色的多樣性，利用基因工程技術(shù)將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化到植物中以改變花色已變得可能。自1987年利用基因工程手段獲得磚紅色矮牽牛后，目前已分離了許多花色相關(guān)的基因，基因工程的發(fā)展為新品種的培育提供了有利的途徑。但花色素受多種元件和因子調(diào)控，其形成途徑是一個(gè)非常復(fù)雜的代謝過(guò)程，至今仍然很難隨心所欲地進(jìn)行花色修飾。隨著花色基因工程的研究和分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，以及花青素途徑各種轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因的機(jī)制的闡明，相信今后隨著基因活性調(diào)控機(jī)制的揭示和基因工程技術(shù)的日趨成熟，人們必將創(chuàng)造出一個(gè)更加色彩繽紛的世界。

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（責(zé)任編輯：劉昀）