馮天雨

摘 要 為了明確木霉T34種類及其對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的致死活性，研究采用形態(tài)學(xué)和ITS分子方法對T34進(jìn)行物種鑒定，并測定T34發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的致死活性。結(jié)果表明：木霉T34為哈慈木霉，其發(fā)酵液濃度為99.63%時，在防治植物線蟲上具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 木霉T34；根結(jié)線蟲；二齡幼蟲；相對抑制率；校正死亡

中圖分類號：S436.412 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.011

木霉菌，也叫綠霉，其適應(yīng)能力很強(qiáng)，在很大的溫度范圍以內(nèi)均可以正常生長發(fā)育，更有甚者連陽光都沒辦法曬死，繁衍速率十分驚人，一小片的菌絲也可以快速分枝蔓延成為菌落。木霉菌在土壤微生物區(qū)系中有著舉足輕重的地位，木霉菌廣泛存在于泥土、根圍、葉周圍、種子和球莖等生態(tài)環(huán)境中。木霉菌作為普遍應(yīng)用的一種拮抗類微生物，在植物病害生物防治的過程中具有不容輕忽的地位，是普遍認(rèn)為最具潛力的生防因素。木霉菌的拮抗能力具備涉及范圍廣、種類多的性質(zhì)。調(diào)查表明，最少有17個屬28個種的病原真菌都對木霉菌存在著拮抗作用[1]。

廣泛使用的化學(xué)殺線劑不僅對人、畜有害，使環(huán)境遭到污染，而且效果持續(xù)期短暫，導(dǎo)致出現(xiàn)線蟲密度迅速回升等問題。從地區(qū)分布來看，植物受害程度較為嚴(yán)重的地區(qū)為溫帶、亞熱帶、熱帶區(qū)域，病害直接使作物產(chǎn)量減少15%～18%，嚴(yán)重時可達(dá)75%以上[2]。關(guān)于根結(jié)線蟲的預(yù)防及治理，向來以化學(xué)藥劑為首，但使用對環(huán)境污染嚴(yán)重的化學(xué)殺線蟲劑，對人畜安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，因此許多高毒化學(xué)殺線劑已被禁止施用。因此，防治該病的有效生物防治策略愈來愈受到人們的關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

木霉菌株T34由河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院病理試驗(yàn)室供給。根結(jié)線蟲從新鄉(xiāng)市萬莊蔬菜大棚（黃瓜）中分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖10～20 g，瓊脂17～20 g，將蒸餾水定容至1 000 mL，充分溶解后趁熱過濾，分別裝入試管中，每個試管中裝入5～10 mL，高壓滅菌鍋滅菌20 min左右后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器設(shè)備

儀器設(shè)備：全自動高壓滅菌鍋，HV-85型，日本平山制造有限公司；干凈工作臺，SW-CJ-IF，姑蘇凈化設(shè)備有限公司；微波爐，P70D20TL-D4型，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，

SHP-250型，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；離心機(jī)，SiGmA 3-18K，德國賽多利斯集團(tuán)；振蕩箱，LQZ-211，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

其他儀器：鑷子、試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、酒精燈、載玻片、濾紙片、打孔器、挑菌針、注射器、離心管、細(xì)菌濾膜和移液槍。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，25～27 ℃培育7 d后觀察菌落特征、分生孢子的大小、形態(tài)。依據(jù)病原菌形態(tài)和大小，依據(jù)《真菌鑒定手冊》進(jìn)行病原鑒別。

1.5 菌株T34 ITS分子鑒定

將菌株T34轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上培育3 d后，挑取菌絲，采納真菌基因組提取試劑盒取得DNA[3]。分子鑒定采用真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS范圍。真菌ITS引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATTGC-3′）[4]，由北京擎科生物有限公司合成引物。PCR 反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。Tef基因PCR反應(yīng)體系同上。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，3 min；9 4℃，45 s；50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30次循環(huán)；

72 ℃，10 min。

PCR產(chǎn)物檢測后，送公司測序。將所得ITS序列在NCBI采取BLAST比對，下載同源性較高的序列，采取MEGA5.0軟件結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 木霉T34發(fā)酵液的制備

在25 ℃的溫度下，將T34菌液發(fā)酵搖瓶培育1周后，將發(fā)酵液通過布氏漏斗抽濾，取粗濾液0.25 ?m微孔濾膜去掉孢子，制成無菌濾液備用。

1.7 根結(jié)線蟲二齡幼蟲獲得

從大棚采集發(fā)病黃瓜根系，用自來水將根表的泥土沖洗掉，挑取卵囊。用5 g/L NaOCl表面消除毒害3 min，用無菌水洗3次后準(zhǔn)備著供隨時使用。將消過毒后的卵囊放到墊有2層擦鏡紙的線蟲分離器中，在常溫下培育3～4 d，便可獲得很多純二齡幼蟲供實(shí)驗(yàn)用。

1.8 木霉T34發(fā)酵液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲活性的干擾

在經(jīng)滅菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入木霉T34發(fā)酵液各1 mL，加1 mL無菌水對照，接下來各自向處理和對照中依次放入新培育的根結(jié)線蟲的二齡幼蟲100條/孔。處理和對照各3次重復(fù)。放進(jìn)常溫培養(yǎng)箱中，48 h后記載線蟲死亡率，算出校正死亡率，經(jīng)過計算得出來的數(shù)據(jù)通過SPSS軟件處理獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 T34菌株形態(tài)鑒定

木霉T34在PDA平板上，培養(yǎng)3 d后，菌絲為白色，見圖1（a）。培養(yǎng)7 d后，菌絲變?yōu)榫G色，為分生孢子梗和分生孢子，見圖1（b）。

2.2 T34、ITS分子鑒定

在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，T34與Hypocrea lixii位于同一進(jìn)化分枝，表明T34與其進(jìn)化關(guān)系較近，結(jié)合形態(tài)和分子鑒定，確定T34為Hypocrea lixii，其無性態(tài)為哈茨木霉。見圖2。

2.3 木霉T34發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的致死活性

木霉T34發(fā)酵液處理48 h后，根結(jié)線蟲二齡幼蟲絕大多數(shù)死掉了，身體呈僵直狀態(tài)[見圖3（b）]。清水對照中，根結(jié)線蟲二齡幼蟲大部分存活，身體彎曲，具有較強(qiáng)活力[見圖3（a）]。結(jié)果證明：木霉T34發(fā)酵液中有對根結(jié)線蟲二齡幼蟲具備致死活性的成分，能夠?qū)⒕€蟲殺死。致死率為92.69%。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)形態(tài)和分子方法將木霉T34鑒定為哈慈木霉，其發(fā)酵液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有強(qiáng)烈的致死活性。

從總的來看，木霉T34發(fā)酵液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲具備著強(qiáng)烈的抑殺作用，二齡幼蟲的校正死亡率在其原液的影響下達(dá)到92.69%。木霉T34發(fā)酵液在根結(jié)線蟲的卵培育為二齡幼蟲時，也是其防治作用相對較好的時期。

木霉T34在預(yù)防和治理作物線蟲上具有廣闊的應(yīng)用前景，不過針對木霉T34的研究才剛剛開始，尚有許多問題需要解決，在防治的理論、方法以及技術(shù)上也存在著新的問題。例如，其對線蟲的作用機(jī)理、對人畜及植物的安全性、長期性和針對性等。

在科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展的情況下，人們對生活環(huán)境質(zhì)量的要求更高，農(nóng)業(yè)資源的可持續(xù)利用，物種的多樣化及其在環(huán)境保護(hù)等方面的研究是現(xiàn)代生物科學(xué)發(fā)展的新趨勢。但根結(jié)線蟲等活體微生物放在大田時給別的種群造成干擾的可能性很大，容易使生態(tài)系統(tǒng)的平衡遭到破壞。根結(jié)線蟲的預(yù)防及治理在根結(jié)線蟲的總的治理上具有舉足輕重的價值。

迄今為止，海內(nèi)外在對根結(jié)線蟲防治的鉆研上展示出特別可觀的應(yīng)用前景，不過大范圍應(yīng)用還存在著一定的問題。同時，通過分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方法，必將讓抗病育種的鉆研工作獲得新的進(jìn)展。此外，基因工程技術(shù)也能夠?yàn)樯镄詺⒕€蟲劑的鉆研發(fā)展與生產(chǎn)提供著強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

在未來，通過化學(xué)農(nóng)藥為重要防治方法的傳統(tǒng)手段必定被以各類防治方法同樣重要的新一類生物防治綜合體系代替?？偟膩碚f，根結(jié)線蟲病的綜合防治依舊任重道遠(yuǎn)。

參考文獻(xiàn)

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[4]Mitchell D E，Gadus M V，Madore M A.Patterns of Assimilate Production and Translocation in Muskmelon（CucumismeloL.） [J].Plant Physiol，1992（99）：959-965.

（責(zé)任編輯：劉昀）