程漢　陳相　黃華孫

摘 要 光呼吸途徑是植物中重要的反應(yīng)途徑，它通過消耗光合作用產(chǎn)物影響作物的產(chǎn)量。乙醇酸氧化酶是該途徑的關(guān)鍵調(diào)控酶，在橡膠樹中尚未見研究報道。本研究分離和鑒定橡膠樹HbGOX1基因的全長cDNA序列，對其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過qPCR技術(shù)進(jìn)一步研究HbGOX1基因在低溫脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因受低溫脅迫負(fù)調(diào)控。此結(jié)果為進(jìn)一步揭示橡膠樹光呼吸途徑在橡膠合成中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 橡膠樹 ；低溫應(yīng)答 ；光呼吸途徑 ；HbGOX1基因

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.005

Abstract Photorespiratory pathway is an important metabolic pathway in plant，which consumes the products of photo-synthesis and reduces crop final yield. Glycolate oxidase is the key regulatory enzyme of this pathway， while the study in rubber tree is absence. In this study， the cDNA sequence of HbGOX1 gene was identified and characterized， and the peptide sequence was analyzed bioinformatically. The expression pattern of HbGOX1 gene was further explored under cold stress. The results showed that this gene was negatively regulated by cold stress. This study provided some fundenmental information for the roles of photorespiration in rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis.

Keywords rubber tree ； cold responding ； photo-respiration pathway ； HbGOX1 gene

巴西橡膠樹是天然橡膠的主要來源。20世紀(jì)中國成功在北緯18°大規(guī)模種植橡膠樹，并建立了海南、云南和廣東三大植膠區(qū)，基本保障了中國對天然橡膠的需求[1]。然而，由于巴西橡膠樹起源于熱帶，對低溫極其敏感，加上中國植膠區(qū)處于熱帶北緣，時常受冬季寒流的影響。除寒害外，中國植膠區(qū)還受旱害、臺風(fēng)和貧瘠等非生物脅迫的威脅。這些因素已經(jīng)成為限制中國植膠事業(yè)的重要限制因子。因此，培育抗逆橡膠品種、研究橡膠樹抗逆的生物學(xué)機理、發(fā)展抗逆栽培方法是中國植膠事業(yè)亟待解決的研究內(nèi)容。

天然橡膠是由聚異戊二烯分子構(gòu)成。在橡膠樹中，通過光合作用合成碳水化合物并運輸至乳管細(xì)胞中，再通過萜類合成途徑進(jìn)一步合成橡膠烴分子。光合作用是天然橡膠生物合成的物質(zhì)和能量來源[2-5]。植物細(xì)胞中的光合作用是通過核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）復(fù)合物催化進(jìn)行，該酶同時具有催化羧化和加氧的功能。前者為催化吸收二氧化碳，合成糖類物質(zhì)；后者則通過氧化作用，進(jìn)入光呼吸途徑，消耗掉光合作用的產(chǎn)物[6-8]。除光合作用外，光呼吸途徑是影響積累生物量的主要因素之一。

乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase，GOX）是光呼吸途徑中的關(guān)鍵調(diào)速酶，該酶催化乙醇酸氧化形成乙醛酸，釋放過氧化氫[7，9]。乙醇酸氧化酶一方面調(diào)控光呼吸途徑，另一方面它釋放的活性氧分子調(diào)控植物非寄主抗病性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[10]。在植物中，該酶活性的缺失往往造成致死突變，如在玉米中，GOX基因的突變株只能在高濃度二氧化碳的空氣中存活[11]。目前，在植物中，對乙醇酸氧化酶所催化的反應(yīng)和參與的途徑都有比較深入的研究，然而對于該基因在光合物質(zhì)積累的影響卻研究較少。在全球氣候變暖和溫室氣體濃度上升的大背景下，氣候變化對植物光呼吸途徑及與農(nóng)作物產(chǎn)量都產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。因此，研究光呼吸途徑在非生物脅迫下的反應(yīng)情況顯得十分重要。乙醇酸氧化酶基因作為光呼吸途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因，它的應(yīng)答情況對光呼吸作用有著重要的影響。筆者從橡膠樹中分離乙醇酸氧化酶基因（HbGOX1），并鑒定該基因的特性和表達(dá)特征，為進(jìn)一步闡述橡膠樹光呼吸途徑在橡膠合成中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗Solexa測序的材料來自巴西橡膠樹抗寒品種93-114，嫁接苗保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所苗圃內(nèi)，待第一蓬葉穩(wěn)定后，搬回實驗室中，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：25℃，16 h光照/8 h黑暗。經(jīng)過一周適應(yīng)性培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移至4℃的低溫培養(yǎng)室進(jìn)行低溫處理。分別在0、2、8和24 h取樣，提取總RNA，送交北京百邁客生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

菌種、Taq酶、pUCm-T載體、DNA凝膠回收試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶等分子生物學(xué)試劑和qPCR試劑盒均購自大連寶生物公司。所有引物及測序均由廣州英駿生物公司完成。其他生化試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 HbGOX1基因及其生物信息學(xué)分析

使用擬南芥AtGOX1基因的編碼蛋白質(zhì)序列，對拼裝好的橡膠樹低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行TBLASTN搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1條Unigene序列與AtGOX1基因高度同源。使用該序列，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行電子克隆，得到一個完整的HbGOX1全長cDNA序列。

HbGOX1基因的ORF預(yù)測通過NCBI的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）程序進(jìn)行，其氨基酸序列的理化特性分析通過ExPASy的在線軟件Compute PI/MW （http：//au.expasy. org/tools/pi_tool.html）、Protparam tool（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）、http：//www.ch.embnet.org/和NCBI的核酸、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征在線分析工具進(jìn)行。氨基酸功能保守區(qū)通過NCBI的CD-Search service工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）進(jìn)行預(yù)測。信號肽預(yù)測采用SignalP 3.0程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行。疏水性圖譜使用ExPASy的ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）進(jìn)行。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行。亞細(xì)胞定位使用Psort程序（http：//psort.nibb.ac.jp）進(jìn)行分析。

1.2.2 HbGOX1全長cDNA的克隆和基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索得到的結(jié)果，設(shè)計引物擴增HbGOX1基因。使用引物對F：GGCACAAATAATCAATCCAGAAAG和R：CATTTCAGTAAGCGGTTGGGAGTG從cDNA上擴增目的片段，回收后克隆至T載體，送交廣州英駿公司測序。將測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的序列進(jìn)行比對，證實擴增的序列來自HbGOX1基因。

利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對HbGOX1的外顯子/內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用MEGA軟件對橡膠樹和其他高等植物的GOX1蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗。

1.2.3 基因的表達(dá)模式分析

基因表達(dá)采用qPCR方法。橡膠樹抗寒品種93-114幼苗經(jīng)過0、0.5、2、8和24 h的低溫處理，提取葉片總RNA，經(jīng)過DnaseI消化、反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行qPCR分析[13]。以橡膠樹18S rRNA基因為內(nèi)參，采用ΔΔct法進(jìn)行定量分析。每個樣品經(jīng)過3個生物學(xué)重復(fù)和3個實驗學(xué)重復(fù)，確保實驗結(jié)果數(shù)據(jù)的一致性。表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)過student t-test進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbGOX1基因的鑒定和序列特征分析

通過同源性搜索，從橡膠樹低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)拼接的Unigene中發(fā)現(xiàn)1條與擬南芥AtGOX1高度同源的DNA序列片段。使用該序列在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行電子延生，得到一條完整的全長cDNA序列，初步命名為HbGOX1。該序列cDNA長度為1 589 bp（圖1-A），使用NCBI的ORF Finder工具從HbGOX1的cDNA序列上發(fā)現(xiàn)1個1 101 bp的編碼區(qū)，推測編碼367個氨基酸的蛋白質(zhì)。對該多肽序列進(jìn)行初步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中存在著1個黃素單核苷酸（FMN）結(jié)合催化激活位點（圖1-B）。該位點是乙醇酸氧化酶家族所共有的結(jié)合位點，也反映該酶在催化反應(yīng)過程中需要FMN輔基的參與。

根據(jù)HbGOX1基因的電子序列設(shè)計引物，從橡膠樹cDNA中擴增HbGOX1的cDNA片段。結(jié)果顯示，擴增到的DNA片段長度約為1.5 kb（圖2）?？寺『笏徒粶y序，并和原電子序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該DNA片段的序列與電子序列一致。表明從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的HbGOX1序列為真實基因的cDNA序列。

2.2 HbGOX1基因的結(jié)構(gòu)分析

利用HbGOX1基因全長cDNA序列，搜索比對橡膠樹全基因組數(shù)據(jù)庫，獲取橡膠樹HbGOX1基因的結(jié)構(gòu)信息。由圖3可知，HbGOX1基因長度為5 810 bp（不包括上下游調(diào)控序列），共由12個外顯子和11個內(nèi)含子組成，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。其中最大的外顯子為536 bp，最小的僅為47 bp。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和較短的外顯子也表明，該基因很有可能在轉(zhuǎn)錄后受RNA剪切水平的調(diào)控[14]。

2.3 HbGOX1編碼多肽序列特征分析

利用EMBOSS的PEPSTATS 工具對推測的HbGOX1蛋白進(jìn)行初步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該推導(dǎo)多肽共有367個氨基酸殘基，分子量約為40.4 ku，等電點為9.44，為堿性蛋白質(zhì)。通過SignalP 4.1程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和ProtScale程序（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）對HbGOX1多肽序列進(jìn)行信號肽和疏水區(qū)搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白的N端不存在明顯的信號肽，也沒有明顯的跨膜區(qū)域。然而，查看HbGOX1蛋白的C末端，發(fā)現(xiàn)存在1個PRL三氨基酸殘基的PTS1信號肽（圖1-A）[15]，表示該蛋白將被定位到過氧化物酶體中。用Psort程序（http：//psort.hgc.jp）對HbGOX1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行可能性預(yù)測分析，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)主要分布在細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中，也會分布到溶酶體和線粒體中（表1）。

2.4 HbGOX1蛋白進(jìn)化分析

將橡膠樹HbGOX1編碼蛋白序列與來自麻風(fēng)樹（Jatropha curcas，XP_012072124.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002519658.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana， NP_188060.1）、巨桉（Eucalyptus grandis， XP_010060801.1）、番茄（Solanum lycopersicum， NP_001294871.1）、大豆（Glycine max， NP_001241302.1）和蓮（Nelumbo nucifera， XP_010275857.1）等7種植物的GOX1蛋白質(zhì)進(jìn)行比對，結(jié)果見圖4。在這8種植物中，GOX1的蛋白質(zhì)序列高度相似，HbGOX1與其他植物的GOX1相似性均在90%以上。表明GOX1蛋白質(zhì)在高等植物中的保守性較高，可能與該蛋白功能上的保守性有關(guān)。

利用MEGA 6.0軟件對橡膠樹和其他7種植物的GOX1蛋白質(zhì)的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，并進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗[12]。結(jié)果表明，橡膠樹的GOX1蛋白與同樣來自大戟科的麻風(fēng)樹和蓖麻親緣關(guān)系較近，分布在一支上，而擬南芥、番茄、桉樹和蓮等分布在另一支，大豆則單獨成為一支（圖5）。

2.5 HbGOX1基因表達(dá)特征分析

橡膠樹受低溫脅迫時，光系統(tǒng)受到傷害，光合作用停止[16]。然而光呼吸系統(tǒng)是否也受到影響不得而知。筆者利用qPCR技術(shù)對橡膠樹HbGOX1基因在低溫脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行研究，以分析光呼吸系統(tǒng)在低溫脅迫下的應(yīng)答情況，結(jié)果見圖6。HbGOX1基因的表達(dá)在橡膠樹受低溫脅迫后持續(xù)降低，2 h后達(dá)到顯著性差異，其后一直維持在較低水平。其中在低溫脅迫8 h后有一個短暫上升，但仍然處于較低水平。這表明橡膠樹HbGOX1基因受到低溫脅迫的負(fù)調(diào)控。

HbGOX1作為光呼吸途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因，其表達(dá)水平的高低影響了光呼吸途徑的效率。HbGOX1基因受到低溫脅迫的負(fù)調(diào)控，表明橡膠樹在低溫脅迫時，降低HbGOX1基因的表達(dá)，以降低光呼吸途徑效率，這與光合作用效率在低溫脅迫下降低是一致的。表明橡膠樹在低溫脅迫時，降低了光合作用和光呼吸，最大限度的降低能量消耗。

3 討論與結(jié)論

乙醇酸氧化酶是植物光呼吸途徑中的關(guān)鍵調(diào)速酶，通過調(diào)控光呼吸途徑而調(diào)節(jié)光合作用產(chǎn)物的積累，因此對農(nóng)作物生物量和產(chǎn)量有著重要的影響[7-8，17]。以前人們往往把光呼吸途徑當(dāng)成植物中消耗能量的浪費步驟，因而想方設(shè)法降低光呼吸途徑的效率，從而提高植物最終生物量的積累[8]。然而，近些年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光呼吸途徑對植物發(fā)育有著重要的影響。首先，光呼吸途徑中的乙醇酸氧化酶所催化的反應(yīng)釋放大量過氧化氫，而過氧化氫又作為信號分子參與植物發(fā)育的各個階段[9]。第二，乙醇酸氧化酶還通過降解乙醇酸在植物中的積累來減低乙醇酸對植物的毒害。在植物中，光呼吸途徑的突變體往往都表現(xiàn)出條件致死表型——在高濃度二氧化碳的氣體中存活，而在平常濃度的空氣死亡。因此，乙醇酸氧化酶基因除了催化植物中最大的產(chǎn)生過氧化氫的反應(yīng)外，還有可能參與植物發(fā)育的各個方面，然而這方面的研究還較為欠缺。

巴西橡膠樹是天然橡膠的主要來源，天然橡膠的合成依賴于光合作用合成的大量蔗糖物質(zhì)。通過運輸?shù)饺楣芗?xì)胞中進(jìn)行聚異戊二烯分子的合成。由于橡膠樹對低溫極其敏感，在15℃左右，橡膠樹的光合作用就趨于停止[16]。而光呼吸作為消耗光合作用能量的副反應(yīng)，其效率水平則直接影響橡膠樹中有機物的消耗。另外，已有研究結(jié)果表明，橡膠樹在低溫脅迫時，釋放大量的活性氧自由基[18]，光呼吸途徑中的乙醇酸氧化酶反應(yīng)是否參與這個過程也不得而知。基于上述2個原因，研究橡膠樹中GOX基因的功能，特別是該基因?qū)τ诘蜏氐姆磻?yīng)就顯得十分重要。通過分析橡膠樹GOX基因在低溫脅迫下的表達(dá)特征，進(jìn)而推測橡膠樹在低溫脅迫下的光呼吸途徑變化，為研究橡膠樹低溫脅迫下的生理反應(yīng)提供更多信息。

本研究通過分析RNA-seq數(shù)據(jù)，從橡膠樹中獲得了一條乙醇酸氧化酶基因，通過分析該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的序列特征、結(jié)構(gòu)域特點和基因結(jié)構(gòu)，并和其他植物的GOX基因進(jìn)行比較分析，初步摸清橡膠樹HbGOX1基因的特點。通過qPCR技術(shù)分析了該基因在低溫脅迫下的表達(dá)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HbGOX1基因受低溫脅迫的負(fù)調(diào)控，表明橡膠樹在受到低溫脅迫時降低了乙醇酸氧化酶基因的表達(dá)，因而推測降低了光呼吸途徑。另外，由于乙醇酸氧化酶定位到過氧化物酶體中，其產(chǎn)生的過氧化氫最終會被抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）等過氧化物酶所降解[19]，因而HbGOX1基因受低溫脅迫的負(fù)調(diào)控也從另外一個層面表明，乙醇酸氧化酶所催化產(chǎn)生過氧化氫的反應(yīng)，可能不是橡膠樹低溫脅迫中活性氧自由基的來源。本研究結(jié)果將為研究橡膠樹中乙醇酸脫氫酶基因及其所參與的光呼吸途徑的生理功能奠定基礎(chǔ)。

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