覃媚　李菲　高成海　余煉　顏棟美

摘要：基于18S rDNA序列分析和GenBank同源性比較，研究采用平板分離法從紅樹無瓣海桑（Sonnera-tia apetala）果實中分離得到20株內(nèi)生真菌，共18個屬。分別對20株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液進行抑菌活性篩選，其中BGMRC1036T的代謝產(chǎn)物對荔枝炭疽病菌（Colletotrichumzloeosporioides）有較好的抑制作用，BGMRC1123T的代謝產(chǎn)物和BGMRC11095T的代謝產(chǎn)物對番木瓜炭疽病菌有較好的抑制作用，BGM-RCl008T的代謝產(chǎn)物對香蕉黑星病菌（Cladosporiumcucumerinum）表現(xiàn)出較好抗菌活性。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；分離；鑒定；抗菌活性

中圖分類號：$432.4⁺4 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2252-04

內(nèi)生真菌（Endophvte）是指那些在生活史的某一段時間能夠與健康的宿主組織形成互利共生關(guān)系，而且在短時間內(nèi)不會引起宿主組織發(fā)生病變的真菌。研究表明，幾乎所有植物中都有內(nèi)生真菌的存在，目前已從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)多種具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、殺蟲、免疫抑制、酶抑制劑或激活劑等的活性代謝產(chǎn)物。它們在醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)的生物防治方面都顯示出重要的應(yīng)用價值。番木瓜、香蕉和荔枝在生長過程中容易染上一些病原菌，從而影響外觀、貯藏和年產(chǎn)量。番木瓜炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、香蕉黑星病菌（CladosporiumcucumeFinum）和荔枝炭疽病菌分別是番木瓜、香蕉和荔枝的3種主要病害的病原菌，目前多采用苯并咪唑類和百菌清等化學(xué)藥物進行防治。已有研究表明，以上3種病原菌菌株對苯并咪唑類藥物的抗性由單基因控制，長期使用易引起基因突變，病原菌抗藥性增強，同時，化學(xué)抗菌藥物的使用也容易導(dǎo)致不同程度的果品污染及農(nóng)藥殘留超標(biāo)，因此尋找新型殺菌劑日益迫切。

紅樹植物常年處于高溫、高鹽、頻繁潮汐、缺氧、強風(fēng)、強紫外線的獨特環(huán)境中，致使其內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富多樣，是許多具有各種活性的先導(dǎo)化合物的重要來源之一。本研究從無瓣海桑（Sonneratia apetala）果實中分離鑒定其內(nèi)生真菌，并對其進行18S rDNA基因鑒定，以確定其分類學(xué)地位。同時進行抗菌活性測試，從中篩選出具有抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌，為新型抗農(nóng)業(yè)病原菌藥物的研究、開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 無瓣海桑果實，采集于廣西欽州茅尾海紅樹林自然保護區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PAD固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、瓊脂2%、馬鈴薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去離子水配制pH6.5：⑦Trehalose-Aspartc Acid（M4）：L-天冬門酰胺1.0g、海藻糖5.0g、復(fù)合鹽溶液10mL、去離子水1000mL、瓊脂粉14g、pH7.2-7.4；③Arginine（M9）：精氨酸1g、甘油6mL、復(fù)合鹽溶液10mL、去離子水1000mL、瓊脂粉14g、pH7.2-7.4；④AGG純化培養(yǎng)基：淀粉10g、甘油5mL、葡萄糖1g、復(fù)合鹽溶液10mL、去離子水1000mL、瓊脂粉14g、pH7.2-7.4；⑤PDA液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、馬鈴薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去離子水配制pH6.5：⑥LB純化培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、pH7.4，去離子水1000mL。

復(fù)合鹽溶液：KNO₃1.000g、NaCl0.500g、MgSO₄·7H₂O0.500g、K₂HPO₄0.500g、NH₄NO₃0.100g、FeSO₄0.010g、MnCl·H₂O0.001g、ZnSO₄·7H₂O0.001g、去離子水100.000mL。

1.1.3 指示菌 番木瓜炭疽病菌、香蕉黑星病菌、荔枝炭疽病菌。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 高壓滅菌器（HVE-50，日本HIRAYAMAHVE公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2112C，上海智城分析儀器制造有限公司）、多功能梯度PCR儀（TGradient，德國Biometra公司）、電泳儀（TanonEPS-100，上海天能科技有限公司）、冷CCD凝膠成像分析系統(tǒng)暗箱（GelLogic2200Pro，Carestream公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100D-W，日本EYELA公司）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 取無瓣海桑果實，用無菌水沖洗干凈，無菌濾紙吸干水分。無菌條件下對其表面消毒：次氯酸鈉（含5%有效氯量）浸泡3min→無菌水沖洗3次→75%乙醇浸泡1min→無菌水沖洗3次，并用無菌濾紙吸干表面無菌水。將無瓣海桑果實切成0.5cm×0.5cm的小塊并進行研磨，研磨好的樣品加入1mL無菌水，混勻后，作為10^-1的植物懸液，再依次制成10^-2、10^-3稀釋度的樣液，分別取各梯度稀釋后的樣液0.2mL，分別接種于PDA、M4、M9和AGG4種不同培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)15d后進行菌落計數(shù)和菌株分離，同時做表面消毒效果對照處理：①將最后1次洗滌無菌水吸取100μL接入培養(yǎng)基中，同等條件下觀察培養(yǎng)。⑦在操作臺上置1個始終開蓋的培養(yǎng)皿，同等條件下觀察培養(yǎng)。如果對照組培養(yǎng)過程中無微生物出現(xiàn)，表明分離得到的菌株是無瓣海桑果實內(nèi)生菌，而不是表面的附生菌。

1.2.2 菌株的鑒定 分子生物學(xué)鑒定：分別用Chelex100法提取菌株基因組DNA為模板，以真菌通用引物NL1（5'-GCATATCAATA-AGCGCAGGAAAAG-3'）和NI4（5'-GGTCCGT-GTTTCAAGACG-3'）為上下游引物擴增菌株的18SrDNA。PCR反應(yīng)體系為（20μL）：無菌水15.6μL，10xBuffer2.0μL，dNTPs（2.5mmol/L）0.4μL，NL1（10pμmol/L）0.4μL，NI4（10μmol/L）0.4μL，基因組總DNA1μL，LATaaDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，52℃退火50s，72℃延伸1s，共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后。72℃延伸維持10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托北京華大基因研究中心進行測序。測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank進行同源性比較，以Glustalx進行多序列比對后，運用MEGA5.0軟件。采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的發(fā)酵及次級代謝產(chǎn)物的提取 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用PDA液體培養(yǎng)基。種子液裝入250mL的三角瓶，每瓶加入120mL培養(yǎng)基。121℃滅菌15min。冷卻至室溫。從平板上接入適量菌種，將分離鑒定得到的真菌菌株接入其中，每個三角瓶接一環(huán)。將已接種的三角瓶移至恒溫培養(yǎng)振蕩器中，150r/min、28℃的搖床上培養(yǎng)7d，將每株真菌菌株分別轉(zhuǎn)接到5個500mL三角瓶中，每瓶200mL培養(yǎng)基，于150r/min、28℃的搖床上培養(yǎng)7d。發(fā)酵得到培養(yǎng)液用細胞破碎儀進行細胞破碎。并用乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。得到真菌次級代謝產(chǎn)物。

1.2.4 抗菌活性試驗 將分離鑒定后得到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液分別用DMSO溶液配制成濃度為5mg/mL。再各取5μL溶液添加到濾紙片（直徑6mm）上。然后置于含番木瓜炭疽病菌、荔枝炭疽病菌和香蕉黑星菌的LB培養(yǎng)基檢測平板上。空白對照為DMSO溶液，陽性對照為多菌靈（濃度為5mg/mL）。37℃培養(yǎng)48h。測量抑菌圉大小。判斷抗菌活性。每個樣品設(shè)3個平行。抑菌圈直徑d≥20mm表示具有強抗菌活性：20mm>抑菌圉直徑d≥10mm表示具有中等抗菌活性：10mm>抑菌圉直徑d>6mm表示具有弱抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

從無瓣海桑果實中共分離得到20株內(nèi)生真菌，分別用Chelexl00法提取菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增、委托北京華大基因研究中心進行測序，將測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其中19株菌的相似性為99%，1株菌的相似性為100%，按照目前通用的真菌分類標(biāo)準(zhǔn)，具有98%～99%序列相似性的菌可以判定為同一個屬。故研究分離得到的內(nèi)生真菌為18個屬，分別為4cidiella sp.、Aspergillus sp.、Aureobasidium sp.、Candida sp.、Cladosporium sp.、Mycosphaerella sp.、Graphiola sp.、Basidiomycot sp.、Hypocreaceae sp.、Coniosporium sp.、Meiraargovae sp.、Neopestalotiopsis sp.、Paecilomyces sp.、Penicillium sp.、Pestalotiopsis sp.、Pseudozyma sp.、Sporisorium sp.、Sporobolomyces sp.，結(jié)果如表1所示。以Glustalx進行多序列比對后。運用MEGA5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

2.2 內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選

從分離鑒定得到的20株內(nèi)生真菌中，篩選得到4株對指示菌具有拮抗作用，其中BGMRC1036T的代謝產(chǎn)物對荔枝炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑為15.0mm），BGMRC1123T的代謝產(chǎn)物和BGMRC1095T的代謝產(chǎn)物對番木瓜炭疽病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性（抑菌圈直徑分別為12.0mm和14.0mm），BGMRC1008T的代謝產(chǎn)物對香蕉黑星菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性（抑菌圈直徑為15.0mm）。分離篩選出的4株內(nèi)生真菌對香蕉黑星病、番木瓜炭疽病和荔枝炭疽病具有較好的拮抗作用，具有作為生物抗菌劑的潛力。

3 小結(jié)與討論

本研究從無瓣海桑果實中分離得到20株內(nèi)生真菌，通過18SrDNA鑒定，并用BLast軟件在Gen-Bank進行同源性比較后確定分離得到的20株內(nèi)生真菌分屬于18個屬。從種屬數(shù)量可以看出，無瓣海桑果實內(nèi)生真菌的種屬比較豐富，反映了紅樹內(nèi)生真菌種屬的多樣性，目前已分離得到的紅樹林真菌超過200多種，成為海洋真菌的第二大類群。紅樹植物內(nèi)生真菌生活環(huán)境的特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有多方面的應(yīng)用潛力。是個潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源。目前，紅樹內(nèi)生真菌主要是從紅樹植物的根際土壤、根、莖、葉幾個部分分離得到，從紅樹的果實尤其是具有一定藥效的可食性紅樹果實中分離鑒定得到的內(nèi)生真菌比較少。

本研究對分離得到的20株內(nèi)生真菌分別進行了抗菌試驗，篩選出4株對香蕉黑星病、番木瓜和荔枝炭疽病具有良好拮抗作用的菌株。其中BGM-RC1036T的代謝產(chǎn)物對荔枝炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑為15.0Him），BGMRC1123T的代謝產(chǎn)物和BGMRC1095T的代謝產(chǎn)物對番木瓜炭疽病菌表現(xiàn)出較好的抑制作用（抑菌圈直徑分別為12.0mm和14.0mm），BGMRC1008T的代謝產(chǎn)物對香蕉黑星病菌表現(xiàn)出較好抗菌活性（抑菌圈直徑為15.0mm）。研究表明。以上4株內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對香蕉黑星病、番木瓜和荔枝炭疽病具有良好的拮抗作用，有待于進一步分離其抑菌單體，為研究新型抗農(nóng)業(yè)病菌藥物提供寶貴的資源。