馬斌博王轉(zhuǎn)子魏 巍黨秉榮李文建

1（蘭州大學(xué)藥學(xué)院 蘭州 730000）2（中國科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000）

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羧甲基-β-1,3-葡聚糖對人B淋巴母細(xì)胞的輻射防護(hù)作用

馬斌博1,2王轉(zhuǎn)子2魏 巍2黨秉榮2李文建1,2

1（蘭州大學(xué)藥學(xué)院 蘭州 730000）
2（中國科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000）

摘要利用X射線輻照經(jīng)羧甲基-β-1,3-葡聚糖預(yù)處理的人B淋巴母細(xì)胞(Human B lymphoblasts, HMy2.CIR)，探究羧甲基-β-1,3-葡聚糖對輻射損傷的防護(hù)作用。采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，并篩選出最佳給藥濃度和孵育時(shí)間(0.1 μg/mL, 72 h)；流式細(xì)胞儀檢測羧甲基-β-1,3-葡聚糖對輻照后HMy2.CIR細(xì)胞凋亡的影響；微核實(shí)驗(yàn)檢測羧甲基-β-1,3-葡聚糖對輻照后HMy2.CIR細(xì)胞微核形成的影響；彗星實(shí)驗(yàn)檢測對DNA損傷程度和修復(fù)的影響。結(jié)果表明，羧甲基-β-1,3-葡聚糖對HMy2.CIR無細(xì)胞毒性并具有增殖促進(jìn)作用；羧甲基-β-1,3-葡聚糖能夠抑制輻射造成的凋亡率和微核率的增加，降低DNA損傷程度，加快損傷DNA的修復(fù)。羧甲基-β-1,3-葡聚糖對HMy2.CIR細(xì)胞輻射損傷有防護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和DNA損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞羧甲基-β-1,3-葡聚糖，人B淋巴母細(xì)胞，X射線輻射，輻射防護(hù)效應(yīng)

基金資助：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11575259)資助

第一作者：馬斌博，男，1987年10月出生，2013年畢業(yè)于西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，現(xiàn)為蘭州大學(xué)在讀碩士研究生，專業(yè)為輻射防護(hù)藥物

Supported by the National Natural Science Foundation of China (11575259)

First author: MA Binbo (male) was born in October 1987, and received his bachelor degree from Southwest University of Science and Technology in 2013. Now he is a master candidate at Lanzhou University, majoring in radioprotector

Received 12 October 2015, accepted 18 January 2016

放射治療是一種有效的腫瘤治療手段，但治療時(shí)射線不能針對特定的腫瘤組織，對腫瘤組織周圍的正常組織也會(huì)造成不必要的輻射損傷[1-2]。不同種類的多糖，例如葡聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等具有抗遺傳毒性、抗氧化、抗輻射、抗感染和抗腫瘤活性，一直被用于增強(qiáng)免疫能力和免疫調(diào)節(jié)[3]。

β-葡聚糖具有預(yù)防癌癥、保肝、降血脂和恢復(fù)造血等對人體有益的功能[4-9]；β-葡聚糖根據(jù)溶解性分為可溶性和不溶性兩類，酵母β-葡聚糖是屬于不溶性的，其在科學(xué)研究、醫(yī)藥、食品和化妝品等相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用受到了極大的制約。本研究所選用的羧甲基-β-1,3-葡聚糖(Carboxymethy-β-1,3-glucan, CMG)由釀酒酵母中的β-葡聚糖通過羧甲基化制備得到。

本文旨在通過羧甲基化對不溶性β-葡聚糖進(jìn)行改性，從而達(dá)到增溶的目的。化學(xué)修飾不會(huì)破壞β-葡聚糖的三股螺旋構(gòu)象[10]，因此修飾后的葡聚糖仍具有免疫增強(qiáng)、抗氧化、抗輻射和抗腫瘤等活性，而且水溶性明顯增加，便于使用，同時(shí)拓寬了酵母β-葡聚糖的應(yīng)用領(lǐng)域[11-12]。不溶性酵母β-葡聚糖的羧甲基化衍生物對細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)還未見報(bào)道。本研究采用人B淋巴母細(xì)胞(HMy2.CIR)，研究了羧甲基-β-1,3-葡聚糖的細(xì)胞毒性效應(yīng)及其對細(xì)胞輻射損傷的防護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

正常人B淋巴母細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，由中科院近代物理研究所生物物理室培養(yǎng)和保藏。用含10%胎牛血清的IMDM(Iscove’s modified Dulbecco medium)培養(yǎng)液(Gibco)（加青霉素和鏈霉素各100 U/mL）培養(yǎng)，呈懸浮生長，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品和儀器

1.2.1 主要藥品

IMDM培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清和磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)(HyClone)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)（日本同仁化學(xué)），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit)（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），DMSO和Triton X-100（上海生工生物工程有限公司），低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(LMPA)、正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(NMPA)、溴化乙錠(EB)和吖淀橙(AO)(SIGMA)、羧甲基-β-1,3-葡聚糖均由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2.2 儀器

RX-650 X射線儀（FAXITRON，美國），流式細(xì)胞儀(Becton Dickinsonand)，AR20ro型酶標(biāo)儀（ANSOSROSIS，瑞典），BX53+DP72光學(xué)熒光成像顯微系統(tǒng)（OLYMPUS，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞照射

取對數(shù)生長期HMy2.CIR，實(shí)驗(yàn)分為以下4組：對照組(Control)、加藥組(CMG)、X射線照射組(IR)以及聯(lián)合組(IR+CMG)。IR和IR+CMG進(jìn)行1.5 Gy 的X射線照射，劑量率為1 Gy/min。

1.4 細(xì)胞毒性及增殖實(shí)驗(yàn)

制備適宜濃度的HMy2.CIR單細(xì)胞懸液，向96孔板中每孔接種3000個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為：空白組（不含細(xì)胞和藥物），對照組（含細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)組（含細(xì)胞和藥物）實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)不同藥物濃度，各處理組6個(gè)復(fù)孔。向各處理組細(xì)胞分別給予不同濃度的CMG（終濃度分別為0、0.01、0.1、1、100、200、400 μg/mL），孵育24、48、72 h后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液。將加入CCK-8的96孔板在37 oC下繼續(xù)反應(yīng)2 h，然后測定各孔在450 nm的吸光值(A)以計(jì)算細(xì)胞存活率(R，%)，重復(fù)3 次，求平均值。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組按1.3節(jié)進(jìn)行。接種適宜濃度的HMy2.CIR的單細(xì)胞懸液于6 孔板中。CMG和IR+CMG的細(xì)胞用0.1 μg/mL藥物預(yù)處理72 h，預(yù)處理后進(jìn)行X射線照射至吸收劑量為1.5 Gy，照射結(jié)束后各不同處理組細(xì)胞立即更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入500 μL Annexin V Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，再加入10 μL的Anexin V-FITC 混勻后，加5 μL的PI，混勻；反應(yīng)15 min，整個(gè)染色過程需避光在室溫條件下進(jìn)行，最后流式上樣檢測早凋和晚凋率。

1.6 微核實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組與處理分別按1.3節(jié)和1.5節(jié)進(jìn)行。IR組和IR+CMG經(jīng)X射線照射至吸收劑量為1.5 Gy，照射結(jié)束后給各不同處理組細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液，分別收集24、48、72 h后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的微核，借鑒參照文獻(xiàn)的微核實(shí)驗(yàn)方法[13]，并略作改進(jìn)，到時(shí)間點(diǎn)后，收集各不同處理組的細(xì)胞，先用低滲液（濃度0.075 mmol/L的KCl）進(jìn)行低滲，然后用固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）進(jìn)行固定，最后滴片，晾干，用50 μg/mL吖啶橙(AO)染色后，將染好的片子置于熒光顯微鏡拍照、觀察，統(tǒng)計(jì)微核。

當(dāng)有多個(gè)微核出現(xiàn)在1個(gè)細(xì)胞中時(shí)，只統(tǒng)計(jì)為1個(gè)微核細(xì)胞。各不同處理組均觀察兩張片子，每張片子上統(tǒng)計(jì)細(xì)胞染色清晰并且結(jié)構(gòu)完整的1000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核率。

1.7 彗星實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組與處理分別按1.3節(jié)和1.5節(jié)進(jìn)行。IR組和IR+CMG經(jīng)X射線照射至吸收劑量為1.5 Gy后分別于0、10 min收集各不同處理組細(xì)胞進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，操作步驟借鑒文獻(xiàn)[14]，并略做改變。

1.7.1 制片

第一層凝膠制備：加熱溶解正常熔點(diǎn)瓊脂糖(Normal melting agarose, NMA)于PBS中，使其濃度為1%，冷卻后在磨砂載玻片上滴加NMA(100～200 μL)，將干凈的蓋玻片立即蓋在滴好的NMA上，使凝膠鋪平整，然后在4 oC下放置15 min使其凝固。第二層凝膠的制備：加熱溶解低熔點(diǎn)瓊脂糖(Low metling agarose, LMA)于PBS中，使其濃度為1%，冷卻到37 oC，移去第一層膠上的蓋玻片，取制備好的適宜濃度的單細(xì)胞懸液80、420 μL的LMA 混勻，迅速將100 μL該含細(xì)胞的混合液滴加到已經(jīng)凝固的第一層膠上，平整和凝固凝膠操作與上一步相同。第三層凝膠的制備：取下第二層膠上的蓋玻片，滴加37 oC恒溫LMA適量(50～100 μL)于第二層已經(jīng)凝固的凝膠上，平整和凝固凝膠操作與上一步相同。

1.7.2 細(xì)胞裂解

將新鮮配制的并事先預(yù)冷的，pH值為10.0的堿性裂解液緩慢地加到鋪平放置好凝膠的磨砂載玻片的平皿中，4 oC下裂解2 h。取出載玻片，雙蒸水漂洗2次。

1.7.3 DNA堿解旋

將載玻片放進(jìn)已經(jīng)加入現(xiàn)配置電泳緩沖液的電泳槽中，使液體高過膠面0.25cm左右，在室溫避光條件下靜置20 min。 細(xì)胞電泳：穩(wěn)壓20 V，電流295～300 mA，遮光電泳20 min。

1.7.4 中和與染色

將電泳完的載玻片輕輕從電泳槽中取出，轉(zhuǎn)移到平皿中，先用雙蒸水漂洗2次，再用pH為7.5，濃度為0.4 mol/L的Tris?HCl緩沖液漂洗3次，漂洗結(jié)束后用PBS緩慢沖洗膠面，然后用濾紙吸干膠面的水分，自然晾干。向各不同處理組的載玻片上滴加2～3滴10 μg/mL的EB進(jìn)行染色，避光反應(yīng)5 min。

1.7.5 觀察、拍照和分析

各不同處理組計(jì)數(shù)兩張玻片，每張計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，共100個(gè)。圖片拍照保存。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 CMG對細(xì)胞增殖的影響

圖1為HMy2.CIR分別給予含0、0.01、0.1、1、100、200、400 μg/mL CMG的完全培養(yǎng)基孵育24、48、72 h后的存活率。各藥物濃度及作用時(shí)間下均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，但基本都表現(xiàn)出了對HMy2.CIR的增殖促進(jìn)作用，從而確定了CMG對細(xì)胞是無毒、安全的。在濃度為0.1 μg/mL，孵育72 h時(shí)對HMy2.CIR的增殖的影響有顯著性，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇用0.1 μg/mL，72 h作為預(yù)處理?xiàng)l件，研究細(xì)胞在接受X射線照射后，CMG是否會(huì)起到輻射防護(hù)的作用。

2.2 CMG對細(xì)胞凋亡的影響

正常的細(xì)胞磷酯酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)處于細(xì)胞膜內(nèi)，而PS在凋亡發(fā)生的早期會(huì)翻轉(zhuǎn)到膜外，此時(shí)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)仍具有完整性，細(xì)胞只會(huì)被FITC標(biāo)記的Annexin-V與外翻的PS結(jié)合，而不會(huì)與PI結(jié)合；到凋亡發(fā)生的晚期，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，兩種染料可以同時(shí)與細(xì)胞結(jié)合。

對FITC/PI雙染后各不同處理組細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率進(jìn)行流式檢測，結(jié)果如圖2所示。CMG和Control相比，HMy2.CIR的早凋和晚凋亡率沒有表現(xiàn)出差異性(p>0.05)，表明CMG不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生；IR和Control相比，早凋和晚凋比例均有所提高，并且表現(xiàn)出差異性(p<0.05)；IR+CMG與IR相比較，早凋和晚凋的比例均有所減少，并且表現(xiàn)出差異性(p<0.05)（圖3）。

2.3 CMG對微核形成的影響

各不同處理組微核率隨著收獲時(shí)間的變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，結(jié)果如圖4所示。IR和Control相比，各時(shí)間點(diǎn)微核率均有升高(p<0.01)；IR+CMG與IR相比，各時(shí)間點(diǎn)的微核率均有降低(p<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，CMG對細(xì)胞的預(yù)處理能夠降低微核的形成。

2.4 CMG對DNA損傷修復(fù)的影響

圖5為通過堿性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)后拍攝的各處理組細(xì)胞的彗星圖像。

彗星尾距實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，細(xì)胞在經(jīng)X射線照射后會(huì)發(fā)生DNA損傷，未修復(fù)和修復(fù)中的IR 和Control相比，尾距差異有顯著性(p<0.01)；照射后零點(diǎn)進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)的未修復(fù)組中IR和IR+CMG相比，尾距有差異性(p<0.05)，表明由X射線照射造成的DNA損傷程度可由CMG預(yù)處理減輕；照射后給予10 min修復(fù)時(shí)間的IR和IR+CMG相比，尾距差異有顯著性(p<0.01)，表明CMG預(yù)處理對DNA損傷修復(fù)也產(chǎn)生了一定促進(jìn)作用。

3 討論

放射治療是一種治療癌癥的有效手段，但是放療時(shí)對正常細(xì)胞的損傷和腫瘤細(xì)胞的放射抵抗性限制了放射治療在癌癥治療中的應(yīng)用。因此，對于放療時(shí)能選擇性地增加腫瘤放療敏感性，同時(shí)能減輕正常組織受到輻射損傷的藥物的研究，已成為放射治療學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

β-葡聚糖可以作為抗癌藥物，但是它對正常的組織和細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用。本研究選擇HMy2.CIR探究CMG生物活性，探究CMG是否能夠減輕細(xì)胞遭受的輻射損傷程度。由CCK-8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著CMG濃度(0.01～400 μg/mL)的增加和孵育時(shí)間(24～72 h)的增加都沒有表現(xiàn)出對細(xì)胞的毒性作用和增殖抑制作用。

諸如電離輻射等外界刺激能夠使細(xì)胞DNA受到不同類型的損傷，損傷的類型包括DNA單鍵(SSBs)、雙鍵的斷裂(DSBs)等，受到損傷的細(xì)胞自身有修復(fù)這些損傷以及阻止損傷所致的突變損傷遺傳進(jìn)入下一代的能力[15]。細(xì)胞受到的損傷需要有足夠的時(shí)間來修復(fù)，這樣就會(huì)出現(xiàn)周期阻滯現(xiàn)象[16-17]，使其停滯在細(xì)胞周期的某一個(gè)階段（例如G2/M期），如果損傷的程度超過了細(xì)胞自身的修復(fù)能力，則細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡的發(fā)生，清除無法進(jìn)行修復(fù)的細(xì)胞。同時(shí)活性氧在電離輻射對細(xì)胞造成的氧化損傷中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，通常情況下機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)的活性氧處于動(dòng)態(tài)平衡[18-19]，由于電離輻射能夠誘導(dǎo)活性氧增加，從而使細(xì)胞內(nèi)活性氧生成和清除的平衡被打破，使細(xì)胞受到氧化損傷。從早凋和晚凋的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，IR+CMG與IR相比，早凋和晚凋率均有所降低，其原因可能是CMG能夠促進(jìn)細(xì)胞清除由于電離輻射產(chǎn)生的多余的自由基，減少活性氧誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生。

根據(jù)抵抗誘變作用機(jī)理的不同，可以把抗誘變劑進(jìn)行以下兩種分類：滅致突變物(Desmutagen)和生物抗致突變物(Bio-antimutagens)。滅致突變物通過直接作用于誘變劑，阻斷其對機(jī)體或者細(xì)胞的作用；生物抗致突變物是在損傷發(fā)生以后，主要通過調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制減輕致突變物對機(jī)體或者細(xì)胞的作用[20]，從而降低致突變物的遺傳毒性。CMG屬于生物抗致突變物，其DNA抗輻射損傷作用可能通過與細(xì)胞上受體結(jié)合，從而激活一些信號通路有關(guān)，例如C型凝集素受體(Dectin-1)和Toll樣受體(TLR)等；也可能與CMG的自由基清除作用有關(guān)。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對于X射線造成的HMy2.CIR SSBs損傷，CMG的預(yù)處理能夠降低這種損傷的程度，這跟早凋和晚凋率變化的結(jié)果也是一致的。

如彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，CMG明顯減輕了輻射所造成的DNA損傷，并提升了受損傷DNA的修復(fù)能力。CMG產(chǎn)生輻射防護(hù)作用的機(jī)理或許跟藥物和HMy2.CIR細(xì)胞膜表面的某種特定受體的結(jié)合有關(guān)，從而介導(dǎo)了特定的細(xì)胞修復(fù)的信號通路的激活。研究證明，β-葡聚糖的受體有Dectin-1、選擇性清道夫受體和補(bǔ)體受體3(CR3, CD11b/CD8)等[21]，其中的Dectin-1作為具有C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域的受體，β-葡聚糖結(jié)構(gòu)中的一些特定糖基可以被其識別。同時(shí)研究證明，在人的大多數(shù)組織中該受體的mRNA均有表達(dá)。巨噬細(xì)胞上的Dectin-1和TLR受體能夠同時(shí)識別酵母β-葡聚糖，兩種受體共同介導(dǎo)酵母多糖的炎癥反應(yīng)，并且在炎癥反應(yīng)發(fā)生的過程中呈現(xiàn)協(xié)同作用，Dectin-1能夠增強(qiáng)TLR介導(dǎo)NF-κB信號通路激活所產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子[22]。因此，CMG的輻射防護(hù)作用可能與Dectin-1和TLR受體結(jié)合，并激活NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

本研究證明CMG成為輻射防護(hù)藥物的潛在可能性，同時(shí)對不溶性β-葡聚糖的開發(fā)利用有重要意義。但對與CMG所結(jié)合的細(xì)胞受體或激活的細(xì)胞信號通路的研究結(jié)果尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，對于CMG確切的作用機(jī)理還需進(jìn)行深入探究。

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Protection effects of carboxymethyl-β-1,3-glucan on human B lymphoblasts’ injury induced by radiation

MA Binbo1,2WANG Zhuanzi2WEI Wei2DANG Bingrong2LI Wenjian1,21(School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)2(Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACTThe aim is to investigate radiation protection effect induced by carboxymethyl-β-1,3-glucan on Human B lymphoblasts(HMy2.CIR). The survival rate of carboxymethyl-β-1,3-glucan on HMy2.CIR was tested by CCK-8 assay at concentrations of 0, 0.01, 0.1, 1, 100, 200 and 400 μg/mL, respectively. The flow cytometry was used to measure the apoptosis rate. Micronucleus rate was assessed by the in vitro micronucleus test. DNA strand breaks were assessed by the comet assay. The results showed that treatment with carboxymethyl-β-1,3-glucan was not cytotoxic. Pre-treatment with carboxymethyl-β-1,3-glucan at concentration of 0.1 μg/mL for 72 h protected HMy2.CIR cells against radiation, as indicated by increased surviving fraction, reduced apoptosis, reduced micronucleus rate and fewer DNA strand breaks. The carboxymethyl-β-1,3-glucan has radiation protection effect onbook=59,ebook=28HMy2.CIR cells, which may be related to inhibition of apoptosis and DNA damage after radiation.

KEYWORDSCarboxymethy-β-1,3-glucan, Human B lymphoblasts, X-ray radiation, Radiation protection effect CLC R979.6, TL71

Corresponding author:Ph.D. LI Wenjian, professor, E-mail: wjli@impcas.ac.cn

收稿日期：初稿2015-10-12；修回2016-01-18

通訊作者：李文建，博士，研究員，E-mail: wjli@impcas.ac.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020205

中圖分類號R979.6，TL71