張曉 蘭曉莉 胡帆 張永學(xué)

430022武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖北省分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

點(diǎn)擊化學(xué)在分子影像學(xué)中的應(yīng)用和進(jìn)展

張曉 蘭曉莉 胡帆 張永學(xué)

430022武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖北省分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

點(diǎn)擊化學(xué)基于其快速高效、高選擇性、生物正交反應(yīng)等特點(diǎn)，在現(xiàn)代化學(xué)發(fā)展及放射性藥物化學(xué)合成中發(fā)揮著日益重要的作用。此外，點(diǎn)擊化學(xué)在放射性探針制備及分子顯像預(yù)定位技術(shù)方面也具有廣泛的應(yīng)用前景。筆者就點(diǎn)擊化學(xué)在分子影像方面的進(jìn)展綜述如下。

點(diǎn)擊化學(xué)；分子影像；分子探針

Fund program:The General Program of National Natural Science Foundation of China（81271623）

1 點(diǎn)擊化學(xué)的基本概念

2001年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主，美國(guó)化學(xué)家Sharpless第一次提出“click chemistry”[1]，即“點(diǎn)擊化學(xué)”或“鏈接化學(xué)”。點(diǎn)擊化學(xué)具有以下優(yōu)勢(shì)：反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單，對(duì)氧和水不敏感；反應(yīng)產(chǎn)率高；產(chǎn)物去除簡(jiǎn)易；反應(yīng)起始原料和反應(yīng)試劑均較易獲得；高效、高選擇性；適用范圍廣[2]?；谝陨蟽?yōu)勢(shì)，點(diǎn)擊化學(xué)一經(jīng)提出便廣受關(guān)注，迅速在化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科得到應(yīng)用，為功能材料、藥物開發(fā)、功能聚合物、表面修飾及生物標(biāo)記等發(fā)展提供了新的啟發(fā)點(diǎn)，成為目前具有發(fā)展前景的合成理念之一[3-5]。

點(diǎn)擊化學(xué)在分子影像學(xué)中應(yīng)用較為廣泛的有銅催化的疊氮和端炔的環(huán)加成反應(yīng)（Cu-catalyzed azide-acetylene cycloaddition，CuAAC）、無銅的[3+2]疊氮-炔烴環(huán)加成反應(yīng)（strain-promoted azidealkyne cycloaddition，SPAAC）、基于巰基的點(diǎn)擊反應(yīng)和Diels-Alder（D-A）反應(yīng)[6-8]。其中CuAAC是最經(jīng)典也是最早應(yīng)用到生物標(biāo)記和分子影像學(xué)中的。相對(duì)于CuAAC，其余3種均為無金屬催化（Cufree）的點(diǎn)擊化學(xué)。點(diǎn)擊化學(xué)的簡(jiǎn)便性及特異性使其與生物小分子或生物大分子的修飾結(jié)合得到極大的發(fā)展，其在分子影像探針合成中的應(yīng)用取得了矚目的成績(jī)[9]。本文就點(diǎn)擊化學(xué)在分子影像學(xué)中的應(yīng)用與發(fā)展作一綜述。

2 點(diǎn)擊化學(xué)的應(yīng)用

2.1 銅催化的環(huán)加成反應(yīng)

CuAAC是由丹麥的Meldal實(shí)驗(yàn)組與美國(guó)的Sharpless實(shí)驗(yàn)組分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)，是由一價(jià)銅催化疊氮和端炔環(huán)加成反應(yīng)生成1，4-二取代1，2，3-三唑的Huisgen偶極環(huán)加成反應(yīng)，極大提高了以往環(huán)加成反應(yīng)的速率[10－11]。一價(jià)銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)具有溫和、迅速、高效、有一定的化學(xué)選擇性且通常不需要保護(hù)基或純化步驟等優(yōu)點(diǎn)。該反應(yīng)中的疊氮和炔烴基團(tuán)均難與生物分子發(fā)生不良反應(yīng)，并且在水中穩(wěn)定性良好，可以在銅催化下在水中快速地進(jìn)行配體交換，使得該反應(yīng)可以很好地應(yīng)用于生物標(biāo)記物合成、分離和活性表達(dá)譜分析等方面。

基于CuAAC反應(yīng)高效簡(jiǎn)便的特性，其在分子影像中的應(yīng)用廣泛，尤其是18F標(biāo)記的PET顯像探針研究越來越受到關(guān)注[12]。傳統(tǒng)的18F標(biāo)記方法主要包括親電取代、無水條件下的親核取代及金屬絡(luò)合[13]（18F標(biāo)記輔基法、固相標(biāo)記法、18F-AlF絡(luò)合標(biāo)記法、18F-19F同位素交換法等），而這幾種標(biāo)記方法對(duì)大多數(shù)生物活性分子標(biāo)記合成步驟繁瑣，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，放射化學(xué)產(chǎn)率較低，易降低生物大分子活性，嚴(yán)重制約了18F標(biāo)記生物大分子顯像探針的應(yīng)用范圍[14]。

應(yīng)用CuAAC技術(shù)引入18F，首先要形成click合成子，即帶有疊氮基或帶有端炔基的18F-click合成子，然后分別與修飾上端炔基或疊氮基的待標(biāo)記的化合物進(jìn)行CuAAC反應(yīng)。常見的合成子有18F-氟化炔烴衍生物（18F-fluoroalkynes）（圖1中A）、2-18F-氟疊氮乙烷（2-18F-fluoroethylazide，18F-FEA）（圖1中B）[15]、含聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）類18F-click合成子（圖1中C）[16]、含苯環(huán)類的18F-click合成子（圖1中D～E）[17]、糖類18F-click合成子（圖1中F）[18]及吡啶類的18F-click合成子（圖1中G）[19]。前兩種純化多采用蒸餾純化，多對(duì)小分子化合物或分子質(zhì)量相對(duì)較小的多肽進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記大分子時(shí)較難分離。含PEG類的合成子水溶性較好，合成時(shí)間短，標(biāo)記率高，揮發(fā)性差，有相對(duì)較好的生物兼容性[20]。18F連接在苯環(huán)上較為穩(wěn)定，因此含苯環(huán)類的合成子難以揮發(fā)、不易發(fā)生體內(nèi)脫氟，且在紫外線下也有吸收，使其較易于通過高效液相色譜進(jìn)行分析。借助于糖類的18F-click合成子標(biāo)記后親水性和生物兼容性的改變，使得多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的生物動(dòng)力學(xué)和清除效率均得到改善。吡啶類合成子目前主要是2-位18F取代的端炔類合成子，也易于合成，在體內(nèi)不易脫氟，穩(wěn)定性好。

圖1 常見的18F-click合成子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of[18F]-prosthetic groups

細(xì)胞凋亡蛋白酶通過破壞修復(fù)DNA蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞形態(tài)等途徑激活細(xì)胞凋亡。近來，Waldmann等[21]使用2-[18F]氟疊氮乙烷標(biāo)記5-（1-磺酰吡咯烷）-7-氮雜靛紅（5-[1-pyrrolidinylsulfonyl]-7-azaisatin），靶向細(xì)胞凋亡蛋白酶 3和 7。應(yīng)用CuAAC反應(yīng)使該顯像劑親水性增強(qiáng)，比以往基于靛紅為基礎(chǔ)的放射性顯像劑有更好的清除率，因而其更適合應(yīng)用于PET顯像研究。Mirfeizi等[22]將含PEG類18F-click合成子（18F-PEGylated alkyne）與4-羥基咔唑疊氮乙基化衍生物進(jìn)行CuAAC反應(yīng)合成顯像探針18F-（fluoromethoxy）ethoxy）methyl）-1H-1,2, 3-triazol-1-yl）propan-2-ol（18F-FPTC），靶向神經(jīng)組織的β-腎上腺素受體。其中click合成子放化產(chǎn)率為74%～89%，總的合成時(shí)間為55 min。該顯像劑較為適宜的脂溶性使其能夠穿透血腦屏障，注射后2 min顱內(nèi)即可達(dá)到攝取的最大值。Daumar等[23]基于實(shí)體腫瘤演變發(fā)展和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生酸性環(huán)境的原理，設(shè)計(jì)合成了吡啶類的18F-click合成子2-乙炔基吡啶（6-[18F]fluoro-2-ethynylpyridine），在Cu（I）催化下對(duì)能夠插入低pH值環(huán)境的肽類（pHLIP）（N端由疊氮基己酸修飾，37個(gè)氨基酸組成）進(jìn)行18F標(biāo)記，其中18F-click合成子放化產(chǎn)率為（27.5±6.6）%，放化純度≥98%，最終產(chǎn)物放化產(chǎn)率為5%～20%，總反應(yīng)時(shí)間為85 min。該顯像劑的生物學(xué)分布和小動(dòng)物PET顯像提示，其可以對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行顯像，在腫瘤組織滯留且具有較高的濃聚，在非靶向組織具有較高的清除率，是十分具有潛力的PET顯像劑。

CuAAC反應(yīng)在核素標(biāo)記應(yīng)用研究方面前景廣闊，使得核素分子影像功能代謝顯像得到更大的發(fā)展。

2.2 無銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)

雖然CuAAC反應(yīng)應(yīng)用最早、最為廣泛，應(yīng)用CuAAC反應(yīng)合成的新型分子影像探針也有較多的報(bào)道，但由于該反應(yīng)使用Cu（I）作為催化劑帶來一定的生物毒性，包括細(xì)胞毒性及誘導(dǎo)病毒或寡核苷酸的降解，這一缺點(diǎn)限制了其在分子影像探針中的應(yīng)用，尤其是其在預(yù)定位技術(shù)方面的應(yīng)用。Codelli等[24]在無銅存在條件下，利用環(huán)張力促進(jìn)[3+2]疊氮-炔烴環(huán)加成方法，避免銅帶來的生物毒性。其中應(yīng)用最廣泛的是氮雜二苯并環(huán)辛炔（azadibenzocyclooctyne，ADIBO）衍生物與疊氮類化學(xué)物進(jìn)行反應(yīng)。Campbell-Verduyn等[25]將13個(gè)氨基酸組成的蛙皮素與ADIBO連接后與18F標(biāo)記的疊氮類化合物進(jìn)行反應(yīng)，該反應(yīng)在室溫條件下僅需10～15 min，與前列腺癌細(xì)胞上的胃泌素釋放肽受體具有較高的親和力。Bouvet等[26]用18F標(biāo)記ADIBO（圖1中G），其與低濃度的疊氮化合物即可進(jìn)行反應(yīng)，且具有較好的生成產(chǎn)率。

2.2.1 D-A反應(yīng)

D-A反應(yīng)是由富電子的雙烯體與缺電子的親雙烯體進(jìn)行[4+2]環(huán)加成反應(yīng)形成穩(wěn)定的六元環(huán)化合物的反應(yīng)，故又稱雙烯合成反應(yīng)，主要是環(huán)戊二烯和呋喃衍生物與馬來酰亞胺（MI）衍生物的反應(yīng)[7]。當(dāng)雙烯體連接上吸電子基團(tuán)，親雙烯體連接上供電子體基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)稱為逆電子需求的D-A反應(yīng)（the inverse electron demand diels-aldercycloaddition，IEDDA），如1，2，4，5-四嗪（tetrazines，TTA）和不飽和烯烴進(jìn)行[4+2]環(huán)加成反應(yīng)。該反應(yīng)具有高選擇性、高產(chǎn)率、生物正交性及生物相容性，是應(yīng)用到生物藥物、高分子材料以及表面修飾等領(lǐng)域的成功范例。

18F標(biāo)記的反式環(huán)辛烷（trans-cyclooctene，18FTCO，圖1中I）是基于D-A反應(yīng)基礎(chǔ)上應(yīng)用最早的18F-click合成子，該標(biāo)記條件較溫和，放化產(chǎn)率高達(dá)70%[27]。18F-TCO與Tetrazine-Cys40-exendin-4室溫反應(yīng)5 min，生成18F-TTCO-Cys40-exendin-4靶向胰高血糖素樣肽受體1（glucagonlike peptide-1 receptor，GLP-1R），該探針在腎臟的攝取較低，可作為臨床上觀察胰島細(xì)胞移植后的潛在顯像探針[28]。11C成功標(biāo)記TTA形成click合成子，放化產(chǎn)率為33%，將其與TCO進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)僅需20 s[29]。此外，將人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）的特異性單克隆抗體曲妥珠單抗烯烴化，然后分別與修飾過的TTA的1，4，7，10-tetraazacyclo-dodecane-1，4，7，10-tetraacetic acid（DOTA）和desferrioxamine（DFO）進(jìn)行反應(yīng)，最后再分別與64Cu、89Zr反應(yīng)，生成的終產(chǎn)物具有較高的放化純度，其在HER2陽(yáng)性乳腺癌的裸鼠小動(dòng)物PET顯像中的特異性及選擇性均較高[30]。D-A反應(yīng)較快的反應(yīng)效率以及生物正交性使其廣泛的體內(nèi)靶向顯像應(yīng)用成為可能。

2.2.2 基于巰基的點(diǎn)擊反應(yīng)

巰基和烯烴反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醇鍵也是應(yīng)用廣泛的無銅點(diǎn)擊反應(yīng)。由于巰基-雙鍵反應(yīng)快速、溫和以及極強(qiáng)的官能團(tuán)適應(yīng)性等特點(diǎn)，近年來在生物化學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域?qū)酆衔镞M(jìn)行功能化己經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。2-氰基苯并噻唑（2-cyanobenzothiazole，CBT）和D-半胱氨酸（D-cysteine，D-Cys）進(jìn)行CBT-Cys點(diǎn)擊反應(yīng)是基于巰基的點(diǎn)擊反應(yīng)中的一種，具有高效、生物兼容性好等特點(diǎn)。18F標(biāo)記6-羥基-2-氰基苯并噻唑（6-hydroxyl-2-CBT，HCBT）與二聚cRGD上N端Cys發(fā)生縮合形成18F-CBTRGD2，該反應(yīng)在溫和的條件下即可得到92%放射化學(xué)產(chǎn)率，該方法提供了標(biāo)記不同的含N端Cys的肽鏈、蛋白及抗體等物質(zhì)的可能性[31]。Casp3/7特異的多肽序列L-Asp-Glu-Val-Asp-D-Cys[DEVD-（D-Cys）]在Casp3/7的作用下解離D-Cys與CBT反應(yīng)形成D-熒光素，并可在激活Casp3/7酶的FVB-luc+小鼠體內(nèi)觀察到強(qiáng)烈的生物自發(fā)光成像信號(hào)[32]?；贔urin酶特異性底物RVRR多肽（Arg-Val-Arg-Arg）合成的包含Gd3+的智能分子探針可在高表達(dá)Furin酶的腫瘤細(xì)胞作用下暴露出1，2-氨基巰基基團(tuán)，隨后該基團(tuán)可與另一個(gè)單體的6-氨基-2-氰基苯并噻唑（6-amino-2-CBT，NCBT）縮合生成環(huán)化的多聚體，即進(jìn)行自組裝，該縮合產(chǎn)物在腫瘤靶組織MR信號(hào)增強(qiáng)[33]。此外該反應(yīng)在光聲成像中也有應(yīng)用[34]。基于巰基的點(diǎn)擊化學(xué)為智能探針進(jìn)行核素成像或治療研究提供了一種新型方法。

2.3 點(diǎn)擊反應(yīng)在預(yù)定位技術(shù)中的應(yīng)用

由于放射免疫顯像使用較大分子量的抗體，其緩慢的藥代動(dòng)力學(xué)使得放射靶向藥物不可避免地產(chǎn)生高本底、增加輻射及較大的不良反應(yīng)等，于是預(yù)靶向成像和治療成為可能的解決方案之一。預(yù)定位在20世紀(jì)80年代中期即被提出，又稱兩步法，即先注射可以和目的組織靶向結(jié)合的特異性分子或藥物，然后再注射可以和特異性分子或藥物特異性結(jié)合的放射性標(biāo)記化合物。生物素-親和素系統(tǒng)在預(yù)定位中應(yīng)用較早，其中親和素可以特異性地結(jié)合4個(gè)生物素，從而產(chǎn)生放大效應(yīng)，但由于親和素相對(duì)分子質(zhì)量較大、內(nèi)源性的生物素及生物素酶的干擾，使其在分子影像中的應(yīng)用受到局限[35]。CuAAC反應(yīng)存在催化劑的生物毒性，SPAAC反應(yīng)有一定的疏水性且其環(huán)辛炔前體合成較為復(fù)雜，成為兩者作為預(yù)定位的難點(diǎn)。于是由于IEDDA藥代動(dòng)力學(xué)反應(yīng)較快、生成產(chǎn)物穩(wěn)定、高選擇性及高親和力，成為分子影像學(xué)中應(yīng)用預(yù)定位技術(shù)的新選擇[36]。

2010年，Rossin等[37]將點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)用于預(yù)定位，先注射靶向TAG72的抗體CC49與TCO相連的結(jié)合物CC49-TCO后，再注射111In標(biāo)記的四嗪類化合物，在體內(nèi)進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，靶與非靶比值增加，為預(yù)定位放射靶向治療和顯像提供了較好的策略。Garcia等[38]同樣采用CC49-TCO預(yù)定位，與99Tcm-HYNIC（6-肼基煙?；?，hydrazinonictinamide）-tetrazine體內(nèi)反應(yīng)，以上兩種顯像劑顯示出預(yù)定位技術(shù)在SPECT顯像中具有極大的應(yīng)用前景。Evans等[39]和Nichols等[40]分別將表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體、AC33抗體與TCO相連進(jìn)行預(yù)定位，四嗪類化學(xué)物與DOTA、二乙烯三胺五乙酸相連后與68Ga反應(yīng)再次注射，該方法為68Ga生物標(biāo)記大分子抗體進(jìn)行預(yù)定位提供了可能。四嗪類的18F-click合成子較易水解，成為應(yīng)用的難點(diǎn)。Devaraj等[41]將18F與聚合物修飾后的四嗪類化合物反應(yīng)形成click合成子，其可與預(yù)先注射的TCO-CD45單克隆抗體進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞預(yù)定位PET顯像的應(yīng)用提供了可行性。

3 小結(jié)

點(diǎn)擊化學(xué)雖需多步合成click合成子，但其在標(biāo)記生物大分子和預(yù)定位技術(shù)方面仍具有廣泛的應(yīng)用前景?？傊S著點(diǎn)擊反應(yīng)技術(shù)的日趨進(jìn)步，點(diǎn)擊化學(xué)將在靶向分子影像探針合成方面做出更多的貢獻(xiàn)，在影像學(xué)診斷與治療上發(fā)揮日益顯著的作用。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 張曉、胡帆負(fù)責(zé)論文起草和撰寫；蘭曉莉、張永學(xué)負(fù)責(zé)最終版本修訂。

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Applications and advances of click chemistry in molecular imaging

Zhang Xiao,Lan Xiaoli,Hu Fan,Zhang Yongxue
Department of Nuclear Medicine,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Hubei Province Key Laboratory of Molecular Imaging,Wuhan 430022,China

Zhang Yongxue,Email：zhyx1229@163.com

Click reaction plays an important role in the development of modern chemistry and radiopharmaceutical synthesis because of its rapid,highly selective,and bioorthogonal characteristics. Furthermore,new radiotracers are beginning to have tremendous utilities of the reactions and a novel pretargeting strategy.The present review focuses on the potential applications of various click chemistry ligations in molecular imaging.

Click chemistry;Molecular imaging;Molecular probe

張永學(xué)，Email：zhyx1229@163.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.03.008

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271623）

2016-02-19）