劉振鋒，戴圣佳，黃小鳴，呂衛(wèi)金，陳士國，劉東紅，葉興乾，*（.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江杭州30058；.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州3004）

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酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽工藝的條件優(yōu)化

劉振鋒1，2，戴圣佳2，黃小鳴2，呂衛(wèi)金2，陳士國1，劉東紅1，葉興乾1，*
（1.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江杭州310058；2.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州310024）

摘要：研究了魷魚皮膠原蛋白肽的酶解加工工藝條件。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)的方法對堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶制備魷魚皮膠原蛋白肽工藝進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的提取工藝條件如下：先用0.3%蛋白酶在pH10.5、溫度47.5℃條件下水解4h，再用0.4%木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶按1∶2（質(zhì)量比）的比例在pH7.5、溫度50℃的條件下繼續(xù)水解4.5h，結(jié)果酶解液的水解度可達(dá)28.89%、DPPH·清除率為88.24%，多肽轉(zhuǎn)化率為49.74%，同時(shí)84.56%的膠原蛋白肽分子量分布介于180 Da～2000 Da之間。在優(yōu)化的酶解條件下，可以得到較好品質(zhì)的膠原蛋白肽產(chǎn)品。

關(guān)鍵詞：魷魚皮；膠原蛋白肽；酶法；正交試驗(yàn)

隨著我國水產(chǎn)品加工業(yè)的迅猛發(fā)展，加工過程中產(chǎn)生大量的廢棄物，包括魚皮、魚鱗和魚骨等，約占魚體總重的50 %～70 %。但是水產(chǎn)品原料利用率低，大量水產(chǎn)品邊角料和廢棄料被加工成飼料，沒有進(jìn)行精深加工，造成資源的極大浪費(fèi)，更嚴(yán)重的是導(dǎo)致環(huán)境污染[1-2]。同時(shí)，水產(chǎn)加工原料利用率低、高附加值產(chǎn)品稀少等成為了水產(chǎn)加工業(yè)面臨的最為突出的問題，嚴(yán)重限制了水產(chǎn)加工業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的延伸和可持續(xù)發(fā)展[3]。

水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物膠原含量很高，且與陸生動物來源的膠原蛋白相比，水產(chǎn)膠原蛋白具有更高的安全性[4]。膠原蛋白肽在消化、吸收、營養(yǎng)等方面具有很多優(yōu)勢，且由于活性中心的暴露而具有很多獨(dú)特的生理活性，如抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、抗衰老、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、降血壓、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[5-9]。當(dāng)前，膠原蛋白肽已經(jīng)被廣泛的用于食品、生物醫(yī)藥及美容化妝品、飼料添加劑以及其他領(lǐng)域[10-12]。

膠原蛋白肽的研究與開發(fā)已成為近年來的熱點(diǎn)，如何快速高效的提取純化膠原蛋白肽成為關(guān)鍵。水產(chǎn)膠原蛋白肽主要通過水解蛋白質(zhì)法，包括酸法、堿法以及酶法獲得。酶法水解比傳統(tǒng)的酸法、堿法提取更為溫和、安全、專一，不僅降解時(shí)間短，產(chǎn)品營養(yǎng)流失較少，而且無環(huán)境污染，是目前常用的活性肽制備方法[13-15]。本文主要通過正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步提取魷魚皮膠原蛋白肽工藝以獲得相關(guān)參數(shù)，并初步分析了獲得的膠原蛋白肽分子量范圍，以期為深度開發(fā)魷魚資源、確保加工下腳料和廢棄物的綜合利用提供試驗(yàn)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

魷魚皮：購于舟山魷魚加工廠，清洗瀝干后貯藏于-20℃冰箱。

堿性蛋白酶（2.4 AU/g）、風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g）：（AU/g：約240 000 U/g～270 000 U/g；LAPU：亮氨酸氨基肽酶單位）諾維信公司；木瓜蛋白酶（200000U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；Gly-Gly-Tyr-Arg：Sigma公司；二苯代苦味?；杂苫―PPH·）、硫酸銅、濃硫酸、硫酸鉀、茚三酮、果糖、甘氨酸、三氯乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸等均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HH2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海嘉鵬科技有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：日本SHIMADZU公司；FD1.0-60型冷凍干燥機(jī)：丹麥Heto公司；臺式冷凍高速離心機(jī)：美國Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水裝置：美國MILLIPORE公司；Kjeltec 2300全自動凱氏定氮儀：瑞典FOSS公司；Waters 600高效液相色譜儀：美國Waters公司；DELTA 320 pH計(jì)：瑞士METTLER TOLEDO公司；JOYN-8000T噴霧干燥機(jī)：上海喬躍實(shí)業(yè)有限公司。

1.3方法

1.3.1原料預(yù)處理

將魷魚皮解凍清洗干凈，用0.5 % NaOH溶液浸泡12 h，去除魷魚皮上的雜蛋白。清水洗凈之后，再用0.2 % HAc溶液浸泡12 h，去除魷魚皮上的脂肪并溶膠。清水洗凈后瀝干、切碎，真空包裝后貯藏于-80℃冰箱，用于后期試驗(yàn)。

1.3.2酶解過程

取20 g魷魚皮置于錐形瓶中，按1∶4（質(zhì)量比）的比例加水，調(diào)節(jié)至合適pH，按適當(dāng)?shù)谋壤砑拥鞍酌福庾∑靠诤笾糜谒″佒写帕嚢杷庖欢〞r(shí)間，取出置沸水中滅酶10min，風(fēng)味蛋白酶與木瓜蛋白酶是在堿性蛋白酶酶解液基礎(chǔ)上進(jìn)行，正交試驗(yàn)時(shí)重復(fù)上述步驟，冷卻搖勻后離心（4 000r/min，10min），得到膠原蛋白水解液，貯藏于4℃冰箱，并及時(shí)測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3水解度的測定

總氮的測定：凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》。

游離氨基氮的測定：參考趙新淮等[16]的方法。取0.100 0 g干燥過的甘氨酸定容至100 mL，取此液分別稀釋成2 μg/mL～20 μg/mL的溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取2 mL稀釋液加入1.0 mL茚三酮顯色劑，搖勻后于沸水浴中加熱15min，冷卻后加入5 mL 40 %乙醇溶液混勻，靜置15min后于570 nm處測定吸光值A(chǔ)，得到的回歸方程為y=0.033 82x + 0.112 74，R2=0.992，甘氨酸的分子量為75.07 Da，所以換算成-NH2的物質(zhì)的量C （μmol）A-C關(guān)系為：C=0.393 9A-0.044 4。測定樣品中-NH2時(shí)，先將水解蛋白液稀釋100倍，取0.40 mL稀釋液于試管中并加1.60 mL超純水、1.0 mL顯色劑，以后操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。水解度計(jì)算公式為：

1.3.4多肽轉(zhuǎn)化率的測定

多肽轉(zhuǎn)化率的測定參考魯偉等[17]的方法，并稍作修改。先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用5 % TCA溶液配制不同濃度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，取4.8 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3.2 mL雙縮脲試劑，混勻后靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液于540 nm處測定吸光值，得到回歸方程y=0.359 6x+0.001 2，R2=0.998。測定樣品中的多肽含量時(shí)，先取2.5 mL樣品溶液，加入2.5 mL 10 %的三氯乙酸溶液，混勻后靜置10min，4 000r/min下離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，并用5 %TCA定容，搖勻，以后操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5DPPH·清除率測定

取蛋白酶解液濃縮，噴霧干燥得魷魚皮膠原蛋白肽粉末。配制5 mg/mL膠原蛋白肽溶液，測定其DPPH·清除率。DPPH·清除率的測定參考寧杰等[18]的方法，并稍作修改。取2 mL DPPH溶液與同體積樣品液混合搖勻在黑暗處反應(yīng)30min，于517 nm波長處測定其吸光值。抑制率計(jì)算公式如下：

DPPH·清除率/% = [1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：Ai為DPPH·與樣品的混合液的吸光度：Aj為乙醇與樣品的混合液的吸光度；A0為DPPH·與水的混合液的吸光度。

1.3.6膠原蛋白肽分子量分布測定

參考曾慶冉[19]的方法，通過Waters 600高效液相色譜儀測量膠原蛋白肽分子量分布，色譜柱是TSK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 nm。吸取2 mL樣品于容量瓶中，用流動相乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0.1）定容，微孔過濾膜過濾后進(jìn)樣，柱溫為30℃，流速為0.5 mL/min，在220 nm下檢測。

1.3.7工藝條件優(yōu)化

以水解度和多肽轉(zhuǎn)化率為評價(jià)指標(biāo)，分別考察水解溫度、pH、水解時(shí)間、加酶量對堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解制備魷魚皮膠原蛋白肽的影響，并在此基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)對水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.7數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0制圖，采用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1酶解條件的確定

分別對堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶做酶解條件的優(yōu)化試驗(yàn)，以水解度和多肽轉(zhuǎn)化率為評價(jià)指標(biāo)，考察水解溫度、pH、水解時(shí)間、加酶量對蛋白酶水解制備魷魚皮膠原蛋白肽的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1顯示酶解溫度、pH條件與蛋白酶的最適反應(yīng)條件相符[20]，反應(yīng)時(shí)間與加酶量也符合生產(chǎn)要求，有利于下一步正交試驗(yàn)的開展。

表1　酶解條件優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the optimization desigh for eneymes

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.2.1堿性蛋白酶的正交試驗(yàn)

堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding results of alcalase

利用極差分析結(jié)果分析，從表2可以看出，以水解度為指標(biāo)的因素影響程度依次為：B、D、C、A，即時(shí)間＞加酶量＞溫度＞pH，最佳組合為：A2B3C2D3；以酶解液抗氧化活性為指標(biāo)的因素影響程度依次為：A、D、C、B，即pH＞加酶量＞溫度＞時(shí)間，最佳組合為：A3B2C3D3；以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)的因素影響程度依次為：D、C、B、A，即加酶量＞溫度＞時(shí)間＞pH，最佳組合為：A1B1C1D2。

3個(gè)指標(biāo)單獨(dú)分析出來的最佳組合條件并不一致，根據(jù)因素對3個(gè)指標(biāo)的影響程度綜合考慮，確定最優(yōu)工藝條件。pH對酶解液抗氧化活性影響很大，因此pH選擇10.5；酶解時(shí)間對酶解液水解度的影響較大，因此酶解時(shí)間選擇4.5 h；酶解溫度對多肽轉(zhuǎn)化率的影響是排在第二位的，對其它兩個(gè)指標(biāo)的影響均排在第三位，所以酶解溫度選擇47.5℃；蛋白酶加酶量對多肽轉(zhuǎn)化率的影響是排第一位的，所以加酶量選擇0.3%。經(jīng)過綜合分析可知，本試驗(yàn)的較優(yōu)條件為A3B3C1D2，即堿性蛋白酶加酶量為0.3 %、酶解溫度為47.5°C、pH為10.5、酶解時(shí)間為4.5 h。在此條件下水解度為14.96 %，DPPH·清除率為83.75 %，多肽轉(zhuǎn)化率為41.05 %。

2.2.2木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的正交試驗(yàn)

木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal array design matrix and corresponding results of the mixed papain and flavorzyme

木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的正交試驗(yàn)過程中，固定加酶總量為0.3 %，按不同比列添加。結(jié)果如表3所示，由極差分析結(jié)果可以看出，以水解度為指標(biāo)的因素影響程度依次為：D、B、C、A，即加酶量比＞時(shí)間＞溫度＞pH，最佳組合為：A2B3C2D3；以酶解液抗氧化活性為指標(biāo)的因素影響程度依次為：D、C、A、B，即加酶量比＞溫度＞pH＞時(shí)間，最佳組合為：A2B2C2D3；以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)的因素影響程度依次為：C、B、D、A，即溫度＞時(shí)間＞加酶量比＞pH，最佳組合為：A1B1C1D2。

反應(yīng)體系的pH對抗氧化活性的影響是排第1位的，pH選擇7.5；時(shí)間對指標(biāo)的影響有兩個(gè)第2位，所以考慮B1和B3，取B3時(shí)，雖然多肽轉(zhuǎn)化率k3比k1下降了3.16 %，但水解度k3比k1增加了5.56 %，時(shí)間選擇4h；溫度對多肽轉(zhuǎn)化率的影響較大，所以溫度選擇50℃；加酶量比對水解度和酶解液抗氧化活性的影響均是取D3較好，所以加酶量比選擇1∶2（質(zhì)量比）。經(jīng)過綜合分析可知，本試驗(yàn)的較優(yōu)條件為A2B3C1D3，該條件下的水解度為19.58 %，DPPH·清除率為87.15 %，多肽轉(zhuǎn)化率為41.79 %。

2.2.3堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶的正交試驗(yàn)

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array design matrix and corresponding results of the three enzymes

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶的正交試驗(yàn)過程是先用堿性蛋白酶在酶解溫度為47.5℃、pH 為10.5的條件下進(jìn)行酶解，再用1∶2的木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在pH 7.5、溫度50℃的條件下二次酶解，分別考察時(shí)間與加酶量的影響。結(jié)果如表4所示，由極差分析結(jié)果可以看出，以水解度為指標(biāo)的因素影響程度依次為：C、D、A、B，最佳組合為：A2B2C3D3；以酶解液抗氧化活性為指標(biāo)的因素影響程度依次為：D、C、B、A，最佳組合為：A1B3C3D3；以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)的因素影響程度依次為：A、B、C、D，最佳組合為：A1B2C2D2。

從結(jié)果可以看出，堿性蛋白酶第一步水解的時(shí)間對最終的酶解液多肽轉(zhuǎn)化率影響很大，因此第一步水解時(shí)間選擇4 h；堿性蛋白酶加酶量對酶解液多肽轉(zhuǎn)化率也是排在第二位的，因此選擇0.3 %；木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的第二步水解時(shí)間對水解度的影響是排在第一位的，所以選擇4.5 h；木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的加酶量對酶解液抗氧化活性的影響是排第一位的，所以加酶量選擇0.4 %。經(jīng)過綜合分析可知，本試驗(yàn)的較優(yōu)條件為A1B2C3D3，即先用0.3 %堿性蛋白酶在pH10.5、溫度47.5℃條件下水解4 h，再用總量為0.4 %的木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶按1∶2（質(zhì)量比）在pH 7.5、溫度50℃的條件下繼續(xù)水解4.5 h。通過對工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)可知魷魚皮在該條件下酶解，其水解度可達(dá)28.89 %、DPPH·清除率為88.24 %，多肽轉(zhuǎn)化率為49.74 %。

2.3膠原蛋白肽分子量分布

在優(yōu)化后工藝條件下制備獲得的膠原蛋白肽分子量分布情況如表5所示。

表5　膠原蛋白肽的分子量分布Table 5 The molecular weight distribution of collagen peptides

由表5可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的兩步水解后制備獲得的膠原蛋白肽分子量較低，97.63 %膠原蛋白肽分子量小于2 000 Da，84.56 %膠原蛋白肽分子量分布介于180 Da～2 000 Da之間，其中，87.25 %膠原蛋白肽分子量小于1 000 Da。膠原蛋白多肽經(jīng)蛋白酶等降解處理后制得的產(chǎn)物分子量通常在200 Da～3 000 Da[20]，與本結(jié)論相類似。表明堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶3種酶復(fù)合酶解有利于小分子肽的形成。十個(gè)氨基酸組成的小肽是比較好的產(chǎn)品，分子量小于1 500 Da，而分子量越小，越容易被有效吸收[21]。所以，通過此工藝提取的膠原蛋白肽品質(zhì)較好，符合市場需求。值得注意的是，產(chǎn)品中分子量小于180 Da的部分比例較高，這可能與風(fēng)味蛋白酶的酶解機(jī)制有關(guān)。風(fēng)味蛋白酶為一種端肽酶，易將蛋白水解成氨基酸，但它對產(chǎn)品風(fēng)味的改善有很大的幫助。

3　結(jié)　論

通過單因素試驗(yàn)，初步考察了酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、加酶量對水解度和多肽轉(zhuǎn)化率的影響，確定了正交試驗(yàn)方案并進(jìn)行條件優(yōu)化。通過多次進(jìn)行正交試驗(yàn)，經(jīng)極差分析，多重比較，得出酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的最佳提取條件為：即先用0.3 %堿性蛋白酶在pH10.5、溫度47.5℃條件下水解4 h，再用總量為0.4 %的木瓜蛋白酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶按1∶2（質(zhì)量比）的比例在pH 7.5、溫度50℃的條件下繼續(xù)水解4.5 h。通過對工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)可知魷魚皮在該條件下酶解，其水解度可達(dá)28.89 %、DPPH·清除率為88.24 %，多肽轉(zhuǎn)化率為49.74 %。通過高效液相分析所得膠原蛋白肽分子量分布，結(jié)果顯示97.63 %膠原蛋白肽分子量小于2 000 Da，具有較好的品質(zhì)和較高的利用價(jià)值。結(jié)論對魷魚皮膠原蛋白肽后期進(jìn)一步的分離純化及應(yīng)用具有較高的的理論指導(dǎo)意義。

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Optimization of Enzymatic Preparation of Collagen Peptides from Squid Skin

LIU Zhen-feng1，2，DAI Sheng-jia2，HUANG Xiao-ming2，Lü Wei-jin2，CHEN Shi-guo1，LIU Dong-hong1，YE Xing-qian1，*
（1.Fuli Institute of Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，Zhejiang，China；2.Zhejiang Yuxiang Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 310024，Zhejiang，China）

Abstract：The enzymatic method of collagen peptides from squid skin was studied.One-factor-at-a-time and orthogonal array methods were used to investigate the optimization of enzymatic preparation of collagen peptides from squid skin.The optimum extraction conditions：firstly，alcalase hydrolyzed for 4 h under the conditions of 47.5℃，pH 10.5 and enzyme concentration 0.3 %，then papain combined flavorzyme（1∶2，quality ratio）hydrolyzed for 4.5 h under the conditions of 50℃，pH 7.5 and enzyme concentration 0.4 %，then the peptides maximum DH was 28.89 %，the DPPH·scavenging rate was 88.24 % and recovery ratio of peptides was 49.74 %，in addition，thecontentofthecollagenpeptideshada molecularweightdistributionof180 Da-2000 Da was84.56 %.Result showed that the qualified peptides could be made under the optimized conditions.

Key words：squid skin；collagen peptides；enzymatic；orthogonal array design

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.018

基金項(xiàng)目：杭州市“雛鷹計(jì)劃”（20131131k132）；富陽市科研攻關(guān)專項(xiàng)（2014NK001）；國家自然科學(xué)基金（31301417）

作者簡介：劉振鋒（1980—），男（漢），高級工程師，博士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通信作者：葉興乾（1962—），男（漢），教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工與食品安全。

收稿日期：2014-09-18 2014-12-03