楊　鍵，張國梁，關(guān)　鍵

(1.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江佳木斯154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

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口腔鱗癌組織中TLR4及NF－κB p65的表達(dá)和意義①

楊鍵1，張國梁2，關(guān)鍵2

(1.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江佳木斯154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要:目的:討論在口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinomas，OSCC)發(fā)生發(fā)展過程中Toll樣受體4 (toll like receptor 4，TLR4)、核因子－κB p65(NF－κB p65)存在的作用。方法:采用免疫組化SABC法分別檢測TLR4、NF－κB p65在11例癌旁正常組織和37例OSCC組織中的表達(dá)情況，討論兩者表達(dá)的相關(guān)性以及與OSCC中不同臨床病理因素之間的關(guān)系。結(jié)果: TLR4、NF－κB p65的陽性率在OSCC組織中較癌旁正常組織高(P均＜0.05) ; TLR4、NF－κB p65的陽性率與OSCC組織的局部侵襲性、分化程度相關(guān)(P均＜0.05)，NF－κB p65的陽性率還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P = 0.023) ; TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的陽性率呈正相關(guān)(r = 0.618，P = 0.000)。結(jié)論: TLR4、NF－κB p65對OSCC的發(fā)生發(fā)展有重要意義。

關(guān)鍵詞:口腔鱗癌;核因子－κB p65; Toll樣受體4;免疫組化

口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinomas，OSCC)多發(fā)于鱗狀上皮覆蓋的部位，它的發(fā)病機制至今還未完全闡明。90%左右的口腔頜面部惡性腫瘤為OSCC，并且近年來呈現(xiàn)逐漸上升且年輕化的趨勢［1］。它的致病因素復(fù)雜，不僅與外在因素如煙酒、物理、化學(xué)刺激相關(guān)，也與內(nèi)在因素如精神、免疫、遺傳相關(guān)。近年來隨著相關(guān)學(xué)科的進(jìn)步，對OSCC的研究也不斷深入，通過研究相關(guān)基因、受體等腫瘤標(biāo)志物在OSCC組織中的表達(dá)情況以便對其發(fā)生和發(fā)展的過程作進(jìn)一步深入了解已經(jīng)成為研究的熱點問題［2］。本實驗通過SABC法分別檢測Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)、核因子－κB p65 (NF－κB p65)在OSCC、癌旁正常組織中的表達(dá)情況，剖析闡述兩者在OSCC、癌旁正常組織中不同表達(dá)特征間的聯(lián)系以及與OSCC臨床病理因素之間存在的關(guān)系，旨在討論OSCC發(fā)生和發(fā)展過程中TLR4、NF－κB p65可能存在的作用。

1　材料和方法

1.1材料

采集佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2013～2015年初經(jīng)本院口腔頜面外科手術(shù)治療并經(jīng)病理診斷為OSCC的成年患者共計37例，上述患者臨床病理學(xué)資料詳實，術(shù)前3個月內(nèi)均未接受放化療，其中男30例，女7例;年齡41～88歲，平均63.8歲;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例;有局部侵襲性33例，無局部侵襲性4例;按照2005年WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)分為高分化10例、中分化23例、低分化4例。另取11例癌旁正常組織，并經(jīng)HE染色，鏡下觀察證明無任何黏膜疾病。以上標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋后按每張4μm的厚度作連續(xù)切片。

1.2試劑

一抗兔抗人TLR4(1: 150)、NF－κB p65(1: 150)親和純化抗體，SABC檢測試劑盒，DAB試劑盒均購于武漢博士德生物有限公司。

1.3方法與判定標(biāo)準(zhǔn)

采用免疫組化SABC法，嚴(yán)格按照說明書要求操作。出現(xiàn)黃或黃褐色為陽性著色，TLR4的表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中，NF－κB p65的表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中。實驗結(jié)果根據(jù)切片的著色強度以及陽性O(shè)SCC細(xì)胞數(shù)在OSCC細(xì)胞總數(shù)中的占比這兩方面進(jìn)行綜合分析判斷，判定OSCC細(xì)胞的著色強度:無著色(－)，淡黃色(+ )，黃色(+ + )，黃褐色(+ + + ) ;判定陽性O(shè)SCC細(xì)胞占比:隨機在切片中選擇5個400倍的高倍細(xì)胞視野，陽性細(xì)胞占比≤10% (－)，11%～25% (+ )，26%～49%(+ + )，≥50% (+ + + ) ; (－)、(+ )、(+ + )、(+ + + )分別代表0分、1分、2分、3分。每張切片按著色強度與陽性O(shè)SCC細(xì)胞在OSCC細(xì)胞中的占比相加得出。陰性(＜2分)，陽性(≥2分)。每批次實驗均設(shè)置空白對照(PBS代替一抗)、陽性對照(已知陽性切片)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件，采用Fisher確切概率法進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較;使用Spearman秩相關(guān)檢驗分析指標(biāo)間的關(guān)系;使用Kruskal－Wallis H檢驗分析病理等級資料。均以α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1 TLR4、NF－κB p65在OSCC、癌旁正常組織中的表達(dá)

在OSCC組織中TLR4、NF－κB p65的陽性率分別為56.8%、54.1%，在癌旁正常組織中的陽性率分別為18.2%、9.0%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05，見表1) ; TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的陽性表達(dá)(見圖1～2)。

免疫組化SABC法檢測OSCC組織中TLR4、NF－κB p65的表達(dá)(箭頭所指處為腫瘤細(xì)胞)。

圖1　TLR4(×400)

圖2　NF－κB p65(×400)

2.2 TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的表達(dá)與

病理因素之間的關(guān)聯(lián)

TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的陽性率與性別、年齡無關(guān)(P均＞0.05)，與分化程度、局部侵襲性有關(guān)(P均＜0.05) ; NF－κB p65的陽性率還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表1。

表1　TLR4和NF－κB p65在癌旁正常組織中的表達(dá)及在OSCC組織中的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系

2.3 TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中表達(dá)關(guān)系

在21例TLR4呈陽性表達(dá)的OSCC組織中，有20例NF－κB p65也呈陽性表達(dá)，兩者在OSCC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r = 0.618，P＜0.01)，見表2。

表2　TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的表達(dá)關(guān)系

3　討論

口腔鱗癌是多種復(fù)雜因素共同作用導(dǎo)致的疾病，要改善患者的預(yù)后，關(guān)鍵就需要做到盡早診斷盡早治療。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展與TLR4、NF－κB p65的過度活化密切相關(guān)［3，4］。研究表明，TLRs通過激活NF－kB所構(gòu)建的腫瘤微環(huán)境在促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有重要的作用。目前TLRs和NF－kB作為多種疾病的治療靶點已經(jīng)成為研究的熱點。

TLRs屬于I型跨膜蛋白，為單個的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，分為胞外結(jié)構(gòu)域(識別受體，介導(dǎo)形成胞外受體復(fù)合物)，跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)信號區(qū)(激活下游信號傳導(dǎo)區(qū)域)，根據(jù)TLRs識別病原相關(guān)分子模式的不同可將其分為不同種類，目前為止發(fā)現(xiàn)的TLRs至少已經(jīng)有11種。其中TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中參與天然免疫的病原相關(guān)分子模式識別受體，在天然免疫和獲得性免疫間起到橋梁作用，腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視及生長轉(zhuǎn)移與它的異常高表達(dá)密切相關(guān)。本研究表明TLR4在OSCC組中的陽性表達(dá)率(56.8%)較癌旁正常組(18.2%)高(P＜0.05) ;同時對不同分化程度的OSCC中TLR4的陽性率(分別為高分化20%、中分化69.6%、低分化75%)，進(jìn)行H檢驗分析，表明隨著OSCC分化程度降低，TLR4的陽性率逐漸增高(P＜0.05) ;此外TLR4的過表達(dá)與OSCC是否存在局部侵襲性密切相關(guān)(P＜0.05)。而且TLR4在OSCC組織中的表達(dá)與年齡、性別(P均＞0.05)無關(guān)，這些都提示TLR4的異常高表達(dá)可能通過相應(yīng)的信號傳遞從而誘發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，在OSCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲過程中起重要作用，這符合王［5］在子宮內(nèi)膜癌中關(guān)于TLR4 和NF－κB p65的研究。

NF－κB是一種可以通過對靶基因的調(diào)節(jié)從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等活動的核轉(zhuǎn)錄因子。NF－κB家族包含五個多肽鏈亞基，在靜息狀態(tài)下它們互相之間以二聚體的形式結(jié)合，無活性的存在于細(xì)胞質(zhì)中，根據(jù)組成二聚體的蛋白不同分為同源或異源兩種，其中主要是p65/p50異二聚體(p65是發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能的主要成分［6］)。當(dāng)NF－κB通路受炎癥、細(xì)胞因子等刺激被激活后，使細(xì)胞質(zhì)中與NF－κB結(jié)合的抑制因子IkB泛素化降解，并最終活化NF－κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，參與多種細(xì)胞的應(yīng)激、增殖、凋亡、合成和分泌細(xì)胞因子等生理病理過程［7］。研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤中都存在NF－κB的過度活化。本研究表明NF－κB p65在OSCC組中的陽性率(54.1%)較癌旁正常組(9.0%)高(P＜0.05)，同時對不同分化程度的OSCC中NF－κB p65的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)其行為與TLR4類似，也是隨著OSCC組織的分化程度降低，NF－κB p65的陽性率增高(P＜0.05)，這符合有關(guān)學(xué)者［8］在胃癌中關(guān)于NF －κB p65的研究。此外NF－κB p65的陽性率在具有局部侵襲性的OSCC組織中異常增高(P＜0.05)，提示NF－κB p65的過表達(dá)在OSCC發(fā)生、發(fā)展、侵襲中可能發(fā)揮重要作用，亦提示NF－κB p65過度活化后在細(xì)胞惡變，癌細(xì)胞增殖、抗調(diào)亡過程可能起到促進(jìn)作用。

同時，對TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計分析后，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)關(guān)系(r = 0.618，P＜0.01)，TLR4可能對NF－κBp65的生成起到正向調(diào)節(jié)作用，兩者在OSCC組織中的表達(dá)變化具有比較顯著的協(xié)同性。提示TLR4 /NF －κBp65通路的過表達(dá)對OSCC的發(fā)生發(fā)展可能起到促進(jìn)作用，其可能原因是該通路參與影響了細(xì)胞間黏附蛋白、細(xì)胞內(nèi)周期蛋白等關(guān)鍵蛋白的的合成，并且調(diào)控了抗凋亡基因的表達(dá)，從而使OSCC侵襲性變強，分化程度變差并且出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移?？梢栽O(shè)想，對通路關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行控制可能是用于治療OSCC的新思路。此外本次研究還發(fā)現(xiàn)在OSCC組織中NF－κB p65的陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，提示NF－κB p65的過度活化可能參與了OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，但是與NF－κB p65不同的是，TLR4在OSCC組織中的陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移因素?zé)o明顯相關(guān)性(P = 0.05)，這個結(jié)果可能與本次實驗收集的OSCC例數(shù)太少有關(guān)，也可能提示TLR4/NF－κB p65信號通路可能受多種因素調(diào)控影響。

綜上所述，通過聯(lián)合檢測分析TLR4、NF－κB p65在OSCC中的表達(dá)情況對于臨床上OSCC的診斷、惡性程度的評估有現(xiàn)實意義。下一步研究準(zhǔn)備通過分別抑制OSCC細(xì)胞中TLR4、NF－κB p65的表達(dá)，檢測分析兩者對OSCC細(xì)胞增殖、凋亡等影響，以期為OSCC的預(yù)防和靶向治療提供新線索。

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(收稿日期:2015－07－30)

通訊作者:關(guān)鍵(1969～)男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: guanjian1207@163.com。

作者簡介:楊鍵(1990～)男，浙江臨安人，在讀碩士研究生。

基金項目:①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號: LM2014－040。

中圖分類號:R739.81

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0047－03