李洪亮，周　漫，丁冶春，范小娜

(贛南醫(yī)學(xué)院1．藥學(xué)院; 2．科研處，江西　贛州　341000)

?

六月雪水提取物體外清除羥自由基活性的實(shí)驗(yàn)研究*

李洪亮1，周漫1，丁冶春1，范小娜2

(贛南醫(yī)學(xué)院1．藥學(xué)院; 2．科研處，江西贛州341000)

摘要:目的:探討六月雪水提取物體外清除羥自由基活性，證明六月雪水提取物胃黏膜損傷的保護(hù)作用是否與清除自由基有關(guān)。方法:基于抗壞血酸還原Cu(2 +)為Cu+，Cu+還原H2O2形成羥自由基·OH，·OH氧化鄰菲羅啉，使其處于激發(fā)態(tài)，退激發(fā)時(shí)發(fā)光?？寡趸瘎┛梢郧宄H，可以減少激發(fā)態(tài)鄰菲羅啉的產(chǎn)生，使發(fā)光強(qiáng)度降低，運(yùn)用此技術(shù)檢測(cè)六月雪水提取物體外清除羥自由基的能力。結(jié)果:在六月雪水提取物的原濃度(3 000．000 mg·mL(－1))時(shí)，羥自由基被清除了98．978%，隨著六月雪水提取物溶液的稀釋，其清除羥自由基的能力逐漸降低，當(dāng)稀釋為原濃度的1/16 384濃度(0．183 mg·mL(－1))時(shí)，六月雪水提取物溶液清除羥自由基的能力與空白組比較接近。結(jié)論:六月雪水提取物具有良好的體外清除羥自由基活性的能力，隨著六月雪水提取物溶液的稀釋，其清除羥自由基的能力逐漸降低。

關(guān)鍵詞:六月雪水提取物;羥自由基;鄰苯三酚

六月雪Serissa Serissoides(DC．) Druce(SSD)來源于茜草科植物小灌木白馬骨的全草或根，主要含有揮發(fā)油類、甾體類、萜類以及糖類等化學(xué)成分;其性涼、味苦、微辛，歸肺、脾、肝、胃經(jīng)［1］。具有疏風(fēng)利濕、清熱解毒的功效，臨床上主要用于時(shí)行感冒，咳嗽咽痛，牙齦腫痛，目赤腫痛，濕熱黃疸，暑濕瀉痢，淋濁帶下，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，歷節(jié)風(fēng)痛，跌打損傷以及癰疽腫毒，瘰疬惡瘡等癥［2］。本課題組主要針對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)作用通過無水乙醇法、阿司匹林法、水浸應(yīng)激法及利血平法實(shí)驗(yàn)小鼠胃黏膜損傷動(dòng)物模型，測(cè)定給藥后胃黏膜損傷面積，結(jié)果證明六月雪對(duì)胃黏膜損傷具有保護(hù)作用［3］。在對(duì)無水乙醇胃飼誘發(fā)急性胃黏膜損傷的動(dòng)物模型考察研究中發(fā)現(xiàn)，六月雪提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃黏膜損傷具有顯著的修復(fù)作用［4］。為了進(jìn)一步研究探討六月雪對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃黏膜損傷保護(hù)作用機(jī)制，本文重點(diǎn)觀察六月雪水提取物體外清除羥自由基活性的研究，以判斷六月雪對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)作用是否與清除自由基有關(guān)。

1　儀器與試劑

BPCL-1-G-C微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x(中國(guó)科學(xué)院北京生物物理研究所) ;鄰苯三酚，江西洪都化學(xué)制劑廠; 3-氨基鄰苯二甲酰肼(luminol)，Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，上?；瘜W(xué)試劑總廠;其他試劑均為分析純。

2　清除羥自由基(·OH)實(shí)驗(yàn)

2．1試液配制本實(shí)驗(yàn)采用鄰菲羅啉-Cu2 +-抗壞血酸-H2O2體系。

CuSO4溶液: 124．8 mg CuSO4·5H2O溶于雙蒸水至500 mL。

PBS(pH 6．2)溶液: 0．2 mol·L－1NaH2PO4溶液81．5 mL和0．2 mol·L－1Na2HPO4溶液18．5 mL混合后加雙蒸水稀釋至400 mL。

鄰菲羅啉溶液: 19．6 mg鄰菲羅啉溶于PBS(pH 6．2)溶液至100 mL。

Vc溶液: 17．6 mg Vc溶于PBS(pH 6．2)溶液至100 mL。

0．15%H2O2溶液: 30% H2O2溶液加入雙蒸水稀釋至0．15%。

BBS(pH 9．0)溶液: 0．05 mol·L－1Na2B4O7· 10H2O溶液80 mL和0．2 mol·L－1H3BO3溶液20 mL混合。

2．2·OH的產(chǎn)生與清除本反應(yīng)的原理以Fenton反應(yīng)為基礎(chǔ)［5］，抗壞血酸還原Cu2 +為Cu+，Cu+還原H2O2形成羥自由基·OH，·OH氧化鄰菲羅啉，使其處于激發(fā)態(tài)，退激發(fā)時(shí)發(fā)光?？寡趸瘎┛梢郧宄H，·OH對(duì)多元酚類成分主要是脫氫反應(yīng)而被還原，因此可以減少激發(fā)態(tài)鄰菲羅啉的產(chǎn)生，所以發(fā)光強(qiáng)度降低。操作步驟為，在發(fā)光杯中加入50 μL樣品溶液(以相同量的蒸餾水作空白對(duì)照)、50 μL CuSO4溶液、20 μL Vc溶液、50 μL鄰菲羅啉溶液和50 μL 0．15% H2O2溶液，再加入BBS溶液780 μL啟動(dòng)反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度(Chemical Luminescence，CL)。CL值以峰高計(jì)算，根據(jù)CL大小可以判斷物質(zhì)清除·OH的能力。自由基清除率用以下公式計(jì)算。

自由基清除率= (CL空白對(duì)照－CL樣品) / CL空白對(duì)照×100%

鄰菲羅啉-Cu2 +-抗壞血酸-H2O2體系的動(dòng)力曲線見圖1。從該動(dòng)力曲線圖可見，該反應(yīng)在啟動(dòng)后，將在200秒鐘左右出現(xiàn)最高峰，但其淬滅速度比較慢，要到1 000秒之后發(fā)光才基本結(jié)束。

圖1　鄰菲羅啉-Cu2 +-抗壞血酸-H2O2體系動(dòng)態(tài)曲線

②Fenton反應(yīng)，過氧化氫在Cu+作用下被還原成羥自由基(·OH)

③羥自由基(·OH)奪取還原劑的一個(gè)氫而被還原。

④剩余的·OH將鄰啡羅啉氧化為電子激發(fā)態(tài)，退激發(fā)時(shí)釋放一個(gè)光子。

以高濃度逐漸稀釋的方式檢測(cè)不同濃度樣品對(duì)CL的影響，每個(gè)濃度樣品都做相應(yīng)的空白對(duì)照。根據(jù)以上公式計(jì)算對(duì)羥自由基(·OH)的清除率，建立量效關(guān)系曲線，通過量效曲線求算出發(fā)光抑制率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50)值，IC50值反映了樣品對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力。IC50值越小，表明樣品清除羥自由基(·OH)的能力越強(qiáng)。

該體系的工作原理如下:

①Cu2 +被抗壞血酸還原為Cu+。

3　結(jié)果

根據(jù)表1的結(jié)果計(jì)算，六月雪水提取物對(duì)于羥自由基的IC50= 1．169 mg·mL－1。由抑制曲線圖(圖2)可以看到，在原濃度(3 000．000 mg·mL－1)時(shí)，羥自由基基本被完全清除，稀釋為原濃度的1/4、1/16、1/64時(shí)，羥自由基同樣被完全清除(清除率都在99%左右)，稀釋為原濃度的1/256(11．719 mg· mL－1)時(shí)，用超微弱發(fā)光儀可檢測(cè)到少量光子，在隨稀釋濃度的逐漸降低，其清除羥自由基的能力逐漸降低，當(dāng)稀釋為原濃度的1/16 384 (0．183 mg· mL－1)時(shí)，六月雪水提取物對(duì)羥自由基的清除率仍保持在12．727%，說明六月雪水提取物對(duì)羥自由基有極強(qiáng)的清除能力。各曲線達(dá)峰時(shí)間隨濃度的逐漸稀釋而逐漸提前，說明六月雪水提取物在該體系中不僅可以清除羥自由基，而且可以延緩羥自由基的產(chǎn)生。在此反應(yīng)體系中，原濃度的抑制率反而低于初始的幾個(gè)稀釋濃度，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

表1六月雪水提取物對(duì)羥自由基的抑制率

圖2　六月雪水提取物對(duì)羥自由基的抑制曲線

4　討論

過氧化氫(H2O2)是一種活性氧，很容易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并且通過過渡金屬離子參與的Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基(·OH)，引起機(jī)體的氧化損傷，即所謂氧化應(yīng)激反應(yīng)［6］。自由基具有高度的化學(xué)活性，是機(jī)體有效的防御系統(tǒng)，若不能維持一定水平則會(huì)影響機(jī)體的生命活動(dòng)［7］。有研究表明，氧化應(yīng)激和過氧化氫的劑量有關(guān)，低劑量的過氧化氫會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性?；A(chǔ)研究活性氧自由基在體內(nèi)主要有三種形式: H2O2、·OH、O2－，羥自由基它是人體新陳代謝的副產(chǎn)物，可以與生物體內(nèi)的許多物質(zhì)如脂肪酸、蛋白質(zhì)、核酸等作用，造成相關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，在化學(xué)致癌過程中起著不可忽視的作用［8］。羥自由基·OH是體內(nèi)最活潑的自由基，攻擊能力最強(qiáng)，對(duì)機(jī)體危害最大，可導(dǎo)致許多病理變化，如引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并損傷膜結(jié)構(gòu)及功能，因此羥自由基的檢測(cè)對(duì)于自由基的生物作用研究具有重要意義［9］。眾多研究已證明，氧化損傷與衰老、腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈硬化以及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染等均有密切關(guān)系［10］。因此，如何清除自由基，防止氧化對(duì)生物體細(xì)胞和組織的破壞得到了普遍關(guān)注。尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是近年來研究者們關(guān)注的課題。

六月雪在江西贛南18個(gè)縣均有分布、資源十分豐富，六月雪水提取物在贛南民間常用作酒精性胃出血，并且效果十分顯著，前期研究發(fā)現(xiàn)六月雪水提取物單獨(dú)用藥對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷有明顯的修復(fù)作用，能明顯降低潰瘍面積指數(shù)，六月雪與黃花倒水蓮聯(lián)合用藥對(duì)無水乙醇、阿司匹林、鹽酸致大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護(hù)作用，并且有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用機(jī)制可能和凝血因子以及調(diào)節(jié)激素水平有關(guān)［4，11］。羥自由基是應(yīng)激性胃潰瘍的重要致病因子，最近研究發(fā)現(xiàn)六月雪水提取物作為羥自由基清除劑預(yù)先處理大鼠，均可顯著地減輕胃粘膜損傷，應(yīng)激時(shí)，胃粘膜內(nèi)的脂質(zhì)過氧化分解產(chǎn)物丙二醛的含量顯著升高，組織化學(xué)的研究顯示，胃粘膜層含有豐富的黃嘌呤氧化酶，其活性在應(yīng)激時(shí)明顯升高，預(yù)先用六月雪水提取物處理大鼠以抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可使胃粘膜損傷顯著減輕。本實(shí)驗(yàn)我們?cè)俅悟?yàn)證六月雪水提取物在原濃度(3 000．000 mg·mL－1)時(shí)，羥自由基基本被完全清除，稀釋為原濃度的1/4、1/16、1/64時(shí)，羥自由基同樣被完全清除(清除率都在99%左右)，稀釋為原濃度的1/256(11．719 mg·mL－1)時(shí)，用超微弱發(fā)光儀可檢測(cè)到少量光子，在隨稀釋濃度的逐漸降低，其清除羥自由基的能力逐漸降低，當(dāng)稀釋為原濃度的1/16 384(0．183 mg·mL－1)時(shí)，六月雪水提取物對(duì)羥自由基的清除率仍保持在12．727%，說明六月雪水提取物對(duì)羥自由基有極強(qiáng)的清除能力。說明六月雪水提取物在該體系中不僅可以清除羥自由基，而且可以延緩羥自由基的產(chǎn)生。六月雪水提取物中清除自由基活性成分的分離以及清除羥自由基的具體作用機(jī)制，是我們下一步準(zhǔn)備研究的內(nèi)容。

參考文獻(xiàn):

［1］陳書坤．中國(guó)遠(yuǎn)志屬植物分類研究［J］．植物分類學(xué)報(bào)，1991，29(3) : 193．

［2］徐國(guó)鈞，徐珞珊，金蓉鸞，等．中國(guó)藥材學(xué)［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996: 1600．

［3］劉春琪，卑占宇，李洪亮，等．六月雪水提取物對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用［J］．贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26(6) : 824．

［4］李洪亮，程齊來，范小娜．六月雪水提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃黏膜損傷的修復(fù)作用［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20 (2) : 333－334．

［5］賈之慎，鄔建敏，唐孟成．比色法測(cè)定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基［J］．生物化學(xué)與生物物理研究進(jìn)展，1996 (2) : 184－186．

［6］陳美珍，余杰，郭慧敏．大豆分離蛋白酶解物清除羥自由基作用的研究［J］．食品科學(xué)，2002，23(1) : 43－46．

［7］王海寬，趙新淮，姜巖．甘草有效成分分離及其對(duì)自由基的清除能力［J］．食品與機(jī)械，2002，4: 23－24．

［8］孫存普，張建中，段紹瑾，等．自由基生物學(xué)導(dǎo)論［M］．合肥:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1999，23(2) : 184－188．

［9］祁克宗，王林安．自由基和生物抗氧化系統(tǒng)理論與外科學(xué)的關(guān)系［J］．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，23(2) : 171 －174．

［10］薛照輝，吳謀成，羅祖友，等．菜籽肽清除自由基作用的研究們［J］．食品工業(yè)科技，2005，26(10) : 71－75．

［11］丁冶春，李洪亮，孫立波，等．二味中藥復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃黏膜損傷誘導(dǎo)的血液指標(biāo)的影響［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(10) : 2461－2463．

Experimental Study of Serissa Serissoides Water Extraction in Vitro on Hydroxyl Radical Scavenging Activity

LI Hong-liang1，ZHOU Man1，DING Ye-chun1，F(xiàn)ANG Xiao-na2
(1．School of Pharmacy; 2．Scientific Research Department，Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To study the function of water extraction in Serissa serissoides in vitro to scavenge the activities of hydroxyl free radical，and too prove thatthe protective effect of Serissa serissoides water extract on gastric mucosa injury is related to scavenging free radicals．Methods: Cu(2 +)was reduced to Cu+by ascorbic acid，which was in the excited state，and the luminescence of the excitation state．Antioxidants which can scavenge·OH，can decrease the excited state orth ophenanthroline and the emission intensity was employed to detect the scavenging ability of Serissa serissoides water extraction to hydroxyl radical in vitro．Results: With Serissa serissoides water extract of original concentration (3 000．00 mg· mL(－1))，hydroxyl radical was cleared of 98．978%．With the dilution of Serissa serissoides water extract solution，its ability to scavenge hydroxyl free radical decreased gradually．When the concentration of the dilution was the 1/16 384 of the origional concentration (0．183 mg·mL(－1))，the ability of Serissa serissoides water extract solution to scavenge hydroxyl free radical is close to that of the blank group．Conclusion: Serissa serissoides water extract has a good ability to savange the activity of hydroxyl free radical in vitro．As the dilution of the water extract solution in Serissa serissoides，its ability to scavange hydroxyl free radicals is gradually reduced．

Key words:Serissa serissoides water extracts; hydroxyl radical; benzene three phenol

(收稿日期:2015－10－15) (責(zé)任編輯:敖慧斌)

通訊作者:范小娜，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中草藥活性成分篩選及新藥研發(fā)工作。E-mail: fxn918@126．com

*基金項(xiàng)目:江西省自然科學(xué)基金(編號(hào): 20132BAB205078) ;江西省教育廳科技項(xiàng)目(編號(hào): GJJ13680)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．007

中圖分類號(hào):R285．5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－5779(2016) 01－0027－04