袁建清，鐘善全，劉　錚，廖春英

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西　贛州　341000)

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大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)TASK-1表達(dá)及其與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系

袁建清，鐘善全，劉錚，廖春英

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西贛州341000)

摘要:目的:觀察一種新型雙孔鉀離子通道亞單元TASK-1在大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)及其在局灶腦缺血再灌注后的動(dòng)態(tài)變化，探討TASK-1表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系。方法:建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌注模型，采用免疫熒光組化和激光掃描共聚焦觀察大鼠MCAO再灌注后3、7、28 d海馬CA1區(qū)TASK-1和GFAP表達(dá)。結(jié)果:成年大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)大量TASK-1和GFAP雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞，MCAO再灌注后3、7、28 d海馬CA1 區(qū)TASK-1和GFAP表達(dá)逐步上調(diào)，與假手術(shù)組比較均有顯著差異(P＜0．05)。結(jié)論:腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區(qū)TASK-1的表達(dá)上調(diào)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有一定關(guān)系。

關(guān)鍵詞:TASK-1通道;星形膠質(zhì)細(xì)胞;海馬CA1區(qū);腦缺血

星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血病理過(guò)程中起重要作用，在缺血后不同時(shí)程，增殖活化不同，有保護(hù)或加重神經(jīng)元損傷的功能［1－2］。有研究［3－5］表明，雙孔鉀通道TASK-1表達(dá)背景或泄漏K電流，形成細(xì)胞膜靜息電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性，可能參與腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)作用。腦缺血后大鼠海馬TASK-1表達(dá)情況及與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)后大鼠海馬CA1區(qū)TASK-1的表達(dá)變化，探討其與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系，為探索腦缺血治療的新的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料成年(3月齡)健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量250～300 g，由贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。兔抗TASK-1購(gòu)于以色列Alomone Labs公司，小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)購(gòu)于美國(guó)Neomarkers公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、花青素(Cy3)標(biāo)記的驢抗兔IgG、普通小牛血清、普通羊血清和普通驢血清均購(gòu)于美國(guó)Jackson Immuno Research公司，恒冷切片機(jī)(德國(guó)Leica公司CM1900型)，激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司FV500型)。

1．2 MCAO制備及分組應(yīng)用線(xiàn)栓法建立MCAO［6］模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)(sham)、MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 28 d組，每組6只。術(shù)前12 h禁食，自由進(jìn)水。用6%水合氯醛麻醉(300 mg·kg－1體質(zhì)量)，術(shù)中維持動(dòng)物直腸溫度(36．6±0．5)℃。分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，注意避免刺激迷走神經(jīng)。于頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅膠的4-0絲線(xiàn)進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，深度為距離頸總動(dòng)脈分叉處1．8～2．0 cm，1 h后拔出絲線(xiàn)進(jìn)行再灌注。按Longa［6］等神經(jīng)功能評(píng)分1～3分者入選MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 28 d組。假手術(shù)組除不插線(xiàn)栓外余步驟同上，并于24 h后取材。術(shù)后在約20℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1．3熒光免疫組化法檢測(cè)大鼠缺血后海馬CA1區(qū)TASK-1和GFAP的表達(dá)造模后的各組大鼠快速斷頭取腦，將腦組織置于－80℃冷凍保存。－20℃恒冷切片機(jī)自視交叉處開(kāi)始，行10 μm厚連續(xù)冠狀切片。冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4℃)固定15 min，PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驢血清(NDS/PBS)封閉液封閉2 h，棄血清，滴加兔抗TASK-1(1∶200)、小鼠抗GFAP(1 ∶200)，對(duì)照組不加一抗，4℃孵育過(guò)夜; PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加羊抗小鼠FITC(1∶200)和驢抗兔Cy3(1∶200)，室溫避光孵育1 h，流水沖洗40 min后，50%甘油封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為550/565 nm的CY3呈紅色熒光，表示TASK-1蛋白;激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525 nm的FITC呈綠色熒光，表示星形膠質(zhì)細(xì)胞染色;雙標(biāo)陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞為黃色。通過(guò)image pro-plus軟件(version 6．0)來(lái)測(cè)定各組雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(IOD)值。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，呈綠色熒光，TASK-1呈紅色熒光，雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞呈黃色。在大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)形態(tài)正常呈樹(shù)根狀或放射狀的綠色熒光的星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性)，MCAO再灌注后，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大呈活化狀態(tài)，缺血再灌注后3、7、28 d可見(jiàn)TASK-1和GFAP表達(dá)逐漸增強(qiáng)(見(jiàn)圖1)。Sham、MCAO 3 d、MCAO 7 d和MCAO 28 d組海馬CA1區(qū)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的IOD值(×106)分別為: 1．14±0．21，2．14±0．24，2．72± 0．40和4．08±0．60，Sham組與其他三組比較，P均＜0．05; MCAO 28 d組與MCAO 3 d、MCAO 7 d組比較，P＜0．05。

圖1　MCAO再灌注后TASK-1和GFAP在海馬CA1區(qū)表達(dá)變化(×400)

3　討論

雙孔鉀離子通道(K2P，KCNK)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型鉀離子通道，具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(6TMS)和2個(gè)孔道結(jié)構(gòu)(2P)［4］，對(duì)經(jīng)典的鉀通道阻滯劑如四已基胺、4-氨基吡啶等不敏感，但能被體內(nèi)外眾多病理生理因子及化學(xué)、機(jī)械刺激所調(diào)控［7－8］，包括多聚不飽和脂肪酸、神經(jīng)遞質(zhì)、溶血磷脂酸、第二信使、揮發(fā)性麻醉劑，還有細(xì)胞內(nèi)外的pH值、滲透壓、氧分壓的改變、溫度變化及機(jī)械牽張等。K2P表達(dá)具有線(xiàn)性I－V關(guān)系的背景K電流［4］，在細(xì)胞膜電位的復(fù)極化和膜靜息電位的形成中起重要作用，并能穩(wěn)定膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性［4］。通過(guò)鼠類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)K2P基因原位雜交研究顯示，在所有的雙孔鉀離子通道亞型中，有7種表達(dá)于成年鼠類(lèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括TASK-1、TASK-3、TWIK-1、THIK-1、TRAAK、TREK-1和TREK-2［8－11］。

TASK-1是雙孔鉀離子通道的一種亞型，通過(guò)TASK-1基因敲除的小鼠研究表明，TASK-1在腦缺血中可能起著腦保護(hù)作用，TASK-1－/－的小鼠對(duì)腦缺血損傷的敏感性明顯增加［12－13］，腦梗死的面積明顯增大。腦缺血是一種致死率、致殘率極高的常見(jiàn)病。近年來(lái)對(duì)其研究一直集中于神經(jīng)元，但迄今尚無(wú)有效根治措施?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外許多研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血病理過(guò)程中起重要作用，在缺血后不同時(shí)程，增殖活化不同，具有保護(hù)或加重神經(jīng)元損傷的不同功能［14－15］。星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用依賴(lài)于其表達(dá)特征性的具有線(xiàn)性I－V關(guān)系的被動(dòng)電傳導(dǎo)，且具有低的膜電位(－75 mV)及低的膜電阻［16］。有研究表明TASK-1和TREK-1功能性表達(dá)于海馬區(qū)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞，是其特征電傳導(dǎo)的通道基礎(chǔ)，并認(rèn)為腦缺血時(shí)所產(chǎn)生的損傷因子可能通過(guò)作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞K2P來(lái)影響膠質(zhì)細(xì)胞的活化增殖及緩沖功能，從而影響神經(jīng)元的命運(yùn)［17－18］。

本研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TASK-1通道蛋白，MCAO再灌注后，其表達(dá)逐步上調(diào)且與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有一定關(guān)系。因此推測(cè)，腦缺血時(shí)所產(chǎn)生的損傷因子可能通過(guò)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的K2P來(lái)影響膠質(zhì)細(xì)胞的電生理特性、平衡緩沖功能及活化增殖，進(jìn)而影響神經(jīng)元的命運(yùn)，從而可能成為今后缺血性腦卒中治療的潛在靶點(diǎn)。

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Changes in TASK-1 Expression and Its Involvement in Astrogliosis Following Cerebral Ischemia in Rat CA1 region of Hippocampus

YUAN Jian-qing，ZHONGg Shan-quan，LIU Zheng，LIAO Chun-ying
(Dept．of Neurology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To investigate changes in TASK-1 expression and its involvement in astrogliosis following cerebral ischemia in rat CA1 region of hippocampus．Methods: Focal ischemia was induced by temporary middle cerebral artery occlusion (MCAO)．The experimental rats induced by MCAO were sacrificed on days 3，7 and 28 after reperfusion．The expressions of TASK-1 and GFAP on astrocytes in the CA1 region of Hippocampus were detected by immunofluorescence and confocal microscope．Results: TASK-1 was broadly expressed on astrocytes in the CA1 region of hippocampus．After MCAO，the expressions of bothTASK-1 and GFAP on astrocytes were significantly increased at days 3，7，28 following reperfusion．Conclusion: After MCAO，the increased TASK-1 expression on astrocytes in rat CA1 region of hippocampus is related with astrocyte activation．

Key words:TASK-1 channel; Astrocyte; CA1 region of Hippocampus; Cerebral ischemia

(收稿日期:2015－11－02 ) (責(zé)任編輯:敖慧斌)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．006

中圖分類(lèi)號(hào):R743

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－5779(2016) 01－0024－03