李婉珍，朱龍寶，陶玉貴，錢森和（安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241000）

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瓜蔞皮總皂苷提取工藝優(yōu)化及抑制金黃色葡萄球菌活性的研究

李婉珍，朱龍寶，陶玉貴，錢森和
（安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241000）

摘要：為確定瓜蔞皮總皂苷提取的最佳工藝，在對甲醇濃度、固液比、提取時間、提取溫度、超聲波功率進(jìn)行單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平的L9（34）正交試驗優(yōu)化超聲輔助甲醇提取瓜蔞皮總皂苷的提取條件．結(jié)果表明：優(yōu)化的瓜蔞皮總皂苷的提取條件為甲醇濃度50%、料液比1∶15、超聲時間50min、超聲功率150W，提取工藝因子的順序為甲醇濃度＞超聲時間＞料液比＝超聲功率，瓜蔞皮總皂苷提取率由0．739%提高到0．986%．在此基礎(chǔ)上進(jìn)行皂苷提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗，結(jié)果表明，瓜蔞皮總皂苷對金黃色葡萄球菌有抑菌效果，抑菌圈為15．3mm．

關(guān) 鍵 詞：瓜蔞皮；總皂苷；超聲波輔助法；抑菌活性

瓜蔞為葫蘆植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxmi）的干燥成熟果實，是常用的中藥之一．因其含有較為豐富的黃酮、皂苷、生物堿、甾醇、有機(jī)酸、三萜及其苷、蛋白、糖類和色素等物質(zhì)，藥理作用廣泛．具有清熱潤肺、寬胸散結(jié)、緩解胸痹心痛及大便秘結(jié)等功效．藥理研究表明，瓜蔞在抗腫瘤、抗?jié)?、抗菌消炎、促進(jìn)免疫、抗氧化、瀉下等方面效果也比較顯著［1－7］．

國外對瓜蔞藥材的研究大都圍繞在其蛋白凝集素、核糖體滅活蛋白、消炎抗腫瘤活性等方面．有關(guān)中藥總皂甙抑菌方面的研究在國內(nèi)已有相關(guān)報道，而關(guān)于瓜蔞皮總皂甙提取及抗菌方面的研究并未見報道［8－10］．以瓜蔞皮總皂甙提取率為指標(biāo)，優(yōu)化其提取工藝，并比較前后抗菌活性效果，以期為拓寬瓜蔞綜合加工途徑提供技術(shù)參考．

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

（1）材料．瓜蔞皮（Trichosanthes skin）生藥材，由安徽省金寨縣惠農(nóng)瓜蔞專業(yè)合作社提供；供試菌種金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由皖南醫(yī)學(xué)院微生物實驗室提供．

（2）試劑．牛肉膏、甲醇（分析純）、氯化鈉（分析純）、齊墩果酸（分析純）、香草醛（分析純）、硫酸、瓊脂、蛋白胨（生化試劑）．

1．2 儀器與設(shè)備

TD5Z臺式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DFS－200G超聲波振蕩儀（上海析生超聲儀器有限公司）；FC104電子天平（上海精密科學(xué)儀器公司）；BS－IEA恒溫振蕩培養(yǎng)箱（國華電器）；HH－2型恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；DHG－9143BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海菁華科技儀器有限公司）．

1．3 方法

（1）瓜蔞皮總皂苷含量測定．準(zhǔn)確稱取20mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至25mL容量瓶中，配成0．8mg／mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別取0．2mL、0．4mL、0．6mL、0．8mL、1．2mL、1．6mL、2．0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于小燒杯中，冰水浴中加入香草醛硫酸溶液5mL（0．05g香草醛溶于濃度65%硫酸中）搖勻，50℃水浴中加熱20min，取出后冰水浴中冷卻15min，540nm以吸光度（A值）對齊墩果酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．取1．0mL瓜蔞皮提取液按照上述方法測定540nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算皂苷含量及提取率．齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示．

（2）瓜蔞皮三萜皂甙提取工藝．瓜蔞皮烘干→粉碎→稱重→醇提→離心→取上清液→計算提取率→測活性．

（3）樣品預(yù)處理及超聲輔助提?。畬⒐鲜V皮置于50～60℃烘箱中烘24h，冷卻后粉碎，80目篩，取篩下物留作樣品，稱取0．5g樣品，按料液質(zhì)量體積比1∶5（g／mL），采用濃度為40%甲醇作為提取溶劑，提取溫度30℃、超聲波功能75W、超聲波提取30min，3 500r／min離心10min，取上清液為粗提物備用．

以1．3（3）樣品預(yù)處理工藝按表1進(jìn)行單因素水平實驗．以單因素考察試驗結(jié)果為參考，設(shè)計對提取率影響較為明顯的甲醇濃度、料液比、超聲時間、功率4因素3水平的正交試驗L9（34），重復(fù)3次，以皂甙提取率為指標(biāo)．正交試驗因素水平如表2所示．

表1　各單因素實驗水平設(shè)計

表2　正交因素水平表

（4）紙片擴(kuò)散法測定瓜蔞皮皂苷提取物的體外抑菌活性［11－12］．用小型打孔器在濾紙上打孔，得直徑為5mm的圓濾紙片，每張濾紙可以吸收10μL活性提取液，將濾紙片滅菌待用．金黃色葡萄球菌菌苔刮入無菌水后，配制成菌懸液濃度為108CFU／mL的菌懸液．取該菌懸液200μL均勻涂布于無菌牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基上．用鑷子夾取滅過菌的濾紙片，蘸取活性提取物貼于平板表面，培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑大小，以確定樣品抑菌活性．

2 結(jié)果與分析

2．1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇為溶劑測定540nm吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為結(jié)果顯示在質(zhì)量濃度為0．32～1．28mg／mL范圍內(nèi)，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度呈線性關(guān)系．

2．2 單因素實驗及結(jié)果

（1）不同濃度甲醇對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響如圖2所示．由圖2可知，隨著甲醇濃度的升高，瓜蔞皮提取物中總皂苷含量呈現(xiàn)先增后減趨勢．在甲醇濃度為50%時，瓜蔞皮提取物中總皂苷含量達(dá)到最大值，說明皂甙可能在不同濃度甲醇中溶解度不一樣，50%的甲醇為最佳的提取濃度．

（2）不同料液比對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響如圖3所示．由圖3可知，料液比對提取物中總皂苷含量的影響基本上呈上升趨勢．為了減少后續(xù)的工藝從而節(jié)約試劑，選取料液比1∶15作為最適比．

（3）不同超聲波提取時間對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響如圖4所示．由圖4可知，在超聲時間為30～50min的區(qū)間內(nèi)皂苷提取率上升，在超聲時間為50～70min的區(qū)間內(nèi)皂苷提取率下降．在超聲時間為50min時，瓜蔞皮提取物中總皂苷含量達(dá)到最大值，因此，選擇50min作為瓜蔞皮皂苷的最佳提取時間．

圖1　齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線　

圖2　不同甲醇濃度對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響

圖3　不同料液比對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響　

圖4　不同提取時間對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響

（4）不同提取溫度對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響如圖5所示．由圖5可知，隨超聲波提取溫度的變化，瓜蔞皮提取物中總皂苷含量無明顯變化，這說明瓜蔞皮提取物中總皂苷的溶解度隨溫度變化不大．

（5）不同超聲波功率對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響如圖6所示．由圖6可知，在超聲波功率為75～150W的區(qū)間內(nèi)提取物中總皂苷含量上升，在超聲波功率為150～175W的區(qū)間內(nèi)下降，在超聲波功率為150W時瓜蔞皮提取物中總皂苷含量達(dá)到最大值，說明皂甙在其功率下已經(jīng)基本溶出．隨著提取功率的增大，提取率反而降低，這可能是大功能對皂苷物質(zhì)結(jié)構(gòu)有一定破壞作用．

圖5　不同提取溫度對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響　

圖6　不同超聲功率對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響

2．3 正交實驗

正交實驗結(jié)果如表3所示，方差分析如表4所示．由表4可知，甲醇濃度和超聲波時間對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量的影響是顯著的，其中，甲醇濃度的影響最顯著，對瓜蔞皮提取物中總皂苷含量影響最大．影響皂甙提取率因素從大到小的順序依次為甲醇濃度、超聲提取時間、料液比與超聲波功率，即A＞C＞B ＝D，最佳提取條件為A2B2C3D2，即甲醇濃度50%、料液比1∶15、超聲時間50min、超聲功率150W．在最佳條件下，最終瓜蔞皮提取物中總皂苷含量為0．986%，比優(yōu)化前的0．739%提高了0．247%．

表3　正交實驗結(jié)果表

表4　方差分析表

2．4 瓜蔞皮總皂苷前后得率及體外抑菌實驗比較

用無菌濾紙吸取10μL瓜蔞皮總皂苷提取工藝優(yōu)化前提取物與優(yōu)化后提取物進(jìn)行比對試驗，抑菌實驗結(jié)果如圖7所示．由圖7可知，瓜蔞皮總皂苷對供試的金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，且工藝優(yōu)化后提取物抑菌效果明顯好于優(yōu)化前，抑菌圈分別為10．5mm和15．3mm．瓜蔞皮總皂苷對金黃色葡萄球菌抑制效果隨著總皂苷濃度的增大而增大．

圖7　抑菌實驗結(jié)果

3 結(jié)論

根據(jù)正交試驗，超聲波輔助提取瓜蔞皮總皂苷最佳提取條件為甲醇濃度為50%、料液比為1∶15、超聲時間為50min、超聲功率為150W．在該條件下提取率明顯提高，達(dá)到0．986%．采用紙片擴(kuò)散法抑菌實驗表明，瓜蔞皮總皂苷對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，且從抑菌圈直徑可以看出瓜蔞皮總皂苷提取工藝優(yōu)化前后的抑菌效果是有差異的，表明瓜蔞皮總皂苷具有一定抑菌活性．

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Optimization of extraction technology and studying on inhibiting of staphylococcus aureus activity in total saponins from trichosanthes kirilowii maxim peel

LI Wan－zhen，ZHU Long－bao，TAO Yu－gui，QIAN Sen－h(huán)e
（Engineering Technology Research Center of Anhui Microbial Fermentation，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Abstract：In order to optimize the technology for extracting process of total saponins from Trichosanthes kirilowii Maxim peel，on the bases of the single factor experiments for methanol concentration，solid－liquid ratio，extracting time，extracting temperature and Ultrasonic power，the orthogonal experiment L9（34）was designed to optimize the extracting conditions of total saponins．The results showed that the optimal technology for extracting conditions of total saponins were the concentration of methanol 50%，the ratio of solid－liquid of 1∶20，the extracting time of 50min，the Ultrasonic power of 150W．The sequence of extraction process factors is the concentration of methanol＞the extracting＞the ratio of solid －liquid＝the Ultrasonic power．The yield of total saponins increased from 0．739%to 0．986%．Mean while the anti－microbial activity was carried on the extract in vitro，The results showed that the saponins has inhibiting effect on Staphylococcus aureus，with the bacteriostatic ring reaching 15．3mm．

Key words：trichosanthes kirilowii maxim peel；total saponins；ultrasonic－assisted method；antimicrobial activity

基金項目：安徽省自然科學(xué)研究基金資助項目（KJ2013B027）

作者簡介：李婉珍（1979－），女，安徽六安人，講師，博士研究生．

收稿日期：2016－01－10

文章編號：1672－2477（2016）01－0005－05

中圖分類號：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A