黃小瑩++張黎君
摘 要:目的:研究高效液相色譜-電化學法測定大鼠腦脊液中多巴胺含量。方法:高效液相色譜運用Waters Atlantis T3作為色譜柱,且將乙腈-緩沖液(20:80)作為流動相,其pH=5.4,其相應流速則為0.32 mL·min-1。就氟哌啶醇(第一代)和利培酮(第二代)相應抗精神病藥,針對大鼠伏隔核(NAC)及前額葉皮層(mPFC)當中多巴胺釋放所具有的影響予以比較分析。結果:mPFC中多巴胺含量當給與氟哌啶醇之后,均未發(fā)生較大變化,而多巴胺在NAC當中含量則出現(xiàn)明顯升高狀況;當將利培酮給與之后,多巴胺含量在NAC及mPFC當中均存在明顯升高狀況。結論:高效液相色譜-電化學法穩(wěn)定、靈敏及準確,對于腦微透析樣品當中相應多巴胺具體的定量分析更為適用。就第二代抗精神病藥物(利培酮)而言,其可能利用將前額葉皮層相應多巴胺水平予以升高方式,就認知功能及陰性癥狀給與改善。
關鍵詞:高效液相色譜-電化學;大鼠腦脊液;多巴胺
中圖分類號:R917 文獻標識碼:A 文章編號:1006-8937(2016)12-0068-02
多巴胺最為人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)當中十分重要的神經(jīng)遞質(zhì),而帕金森病及精神分裂癥發(fā)病因素則為腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)功能失調(diào),為此,就準確、靈敏及快速分析方法予以建立,并對其濃度予以測定,則對藥物治療、疾病診斷及神經(jīng)生理學研究均具有重要臨床意義[1]。
1 資料與方法
1.1 一般資料
本次研究所選用試劑為甲酸和高氯酸、復方氯化鈉注射液、氟哌啶醇注射液、利培酮粉末、乙二胺四乙酸、無水檸檬酸、谷胱甘肽及鹽酸多巴胺等;所選用儀器為微透析探針和套管、Waters Atlantis T3色譜柱、腦立體定位儀、SCl-10A系統(tǒng)控制器、DGU-12A在線脫氣機、島津LC-20AD泵及手動進樣器等。所選動物為雄性大鼠,平均體重為(259±19.8)g。
1.2 方 法
將所選取相應透析樣品,經(jīng)量取出相應20 μL,而后將其在存有200 μL PCR相應離心管予以放入,而后將5 μL多巴胺穩(wěn)定劑加入,當完成混勻后,運用微量注射器實施取樣操作,劑量為20 μL。采用生理鹽水對氟哌啶醇注射液實施稀釋操作,且將其濃度調(diào)和至1 mg·mL-1;采用利培酮,且其中融入中性酒石酸0.1mol·L-1,實施熔解操作,而后將藥物溶液予以配置,其濃度則為1mg·mL-1。
此外,選取14只SD雄性大鼠,將其依據(jù)隨機方式劃分為三組,各為利培酮組、氟哌啶醇組及空白組。首先麻醉大鼠,并就腦區(qū)mPFC給與定位,此外,還需將NAC給與定位,而后將探針引導管埋置于腦區(qū)內(nèi),且于清醒動物裝置中將大鼠予以妥善放置,當于區(qū)間3~5 d恢復后,在大鼠皮下,將給藥管予以埋置,將插入探針及B030802均插于引導管處,在針入口處,將微量注射泵予以接入,而于出口處,則將接樣管實施接入操作,且對灌流速度予以控制,即為1.4 μL·min-1。采用Ringer's實施液灌流操作,當完成2 h平衡之后,各于30 min,將1份透析液給與收集,且基礎值則為3樣品,當完成皮下注射且給藥之后,對其中3 h樣品給與收集,并采用上述方法實施樣品檢測[2-3]。
2 結 果
2.1 線性關系考察
就多巴胺儲備液給與精密量取,而后采用高氯酸溶液 0.1 mol·L-1,將其與100 nmol·L-1實施結合稀釋操作,而后采用Ringer's液,將上述溶液分別給與0.2、0.5、2、5及20 nmol·L-1等稀釋操作,并依據(jù)上述檢測方法實施檢測。當縱坐標為測物峰面積Y,且橫坐標為待測物濃度X,則運用加權(1/X2)最小二乘法,開展回歸運算操作[4],便可將標準曲線相應回歸方程予以得出:
Y=1.977×105X-1.401×104(r=0.9997)
而多巴胺則于0.2~20 nmol·L-1之間,具有良好的線性關系,依據(jù)信噪比S/N=3,就檢測限予以計算,則為0.05 nmol·L-1;依據(jù)S/N=10,對定量限給與計算,則為0.1 nmol·L-1。
2.2 精密度與回收率
依據(jù)上述配置方法,分別就濃度劃分為低、中及高且各為0.5、2.0及10.0nmol·L-1相應質(zhì)控溶液予以配置,且需各自配置5份,其依據(jù)上述操作步驟,實施5次日內(nèi)連續(xù)進樣操作,且連續(xù)3d實施日間測定,依據(jù)相應隨行標準曲線,將各個質(zhì)控樣品所具有濃度予以求出,且將日間及日內(nèi)相應精密度進行計算,就樣品相應回收率予以計算,見表1。
2.3 大鼠mPFC及NAC中利培酮及氟哌啶醇對其內(nèi)多巴 胺釋放影響分析
依據(jù)上述操作方法,于大鼠皮下,分別將RISP及HAL各為1mg·kg-1,分別于前后順序就NAC及mPFC當中各個時間點,在具體的透析液當中所存在的多巴胺水平,所存在的相應變化率,如圖1所示。
從中可知,mPFC中多巴胺含量當給與氟哌啶醇之后,均未發(fā)生較大變化,而多巴胺在NAC當中含量則出現(xiàn)明顯升高狀況(1.6倍);當將利培酮給與之后,多巴胺含量在NAC及mPFC當中均存在明顯升高狀況,及分別為后者的2.5倍及1.6倍。
3 討 論
多巴胺作為一種極性較強的物質(zhì),通常情況下,其反相色譜柱,對其具有較弱的保留行為,所以,通過對Wasters Atlantis T3色譜柱給與選擇,具有較好的分離效果。此外,在Ringer's溶液當中,多巴胺存在不穩(wěn)定狀況,而在本次實驗當中,將抗氧劑加入至多巴胺 Ringer's溶液之后,對其進行觀察可知,多巴胺具有較好的穩(wěn)定性。針對流動相中水相而言,其相比于有機相比例,則對于多巴胺峰位具有較為顯著的影響,伴隨水相比例相應升高狀況,則多巴胺在具體峰位方面則會出現(xiàn)向后移動狀況,此外,其還對雜質(zhì)峰具有較小的影響。就流動相的pH而言,其也會影響于樣品峰的位置。特別是一些相應雜質(zhì)峰所具有的峰位,則其具有較大的影響[5]。如若pH>4.3,則在具體的腦透析液當中,雜峰就會出現(xiàn)于多巴胺峰附近,對測定形成干擾。如若其值處于小于4.3或之下狀況,則該峰則會出現(xiàn)快速前移狀況,而多巴胺峰峰位則變化不明顯,在有效分離方面可實現(xiàn)。精神分裂癥的發(fā)病,往往和中腦邊緣系統(tǒng)當中,相應多巴胺在具體的功能方面出現(xiàn)紊亂,存在相關性,而對于精神分裂癥狀況下所存在的認知障礙及陰性癥狀,則和mPFC在多巴胺功能方面出現(xiàn)不足相關。
通過本次研究可知,利培酮(非典型抗精神病藥),對于mPFC當中多巴胺相應釋放具有明顯增加狀況,可能和其能夠?qū)φJ知障礙及陰性癥狀予以改善相應機制有關,而氟哌啶醇則無法達到此功效。
參考文獻:
[1] 宋寧寧.高效液相色譜—電化學檢測法測定尿中多巴胺的含量[J].中國職業(yè)醫(yī)學,1999,(4).
[2] 呂允鳳.應用微透析技術和高效液相色譜法測定川芎嗪對大鼠腦內(nèi)多巴胺釋放量的影響[J].藥學學報,2013,(6).
[3] 景富春,劉小莉,陳虹.HPLC-ECD法測定大鼠腦微透析液中的多巴胺及其代謝產(chǎn)物[J].中國臨床藥理學與治療學,2006,(9).
[4] 張向暉,劉軍,蘇林雁.庫侖陣列電化學高效液相色譜法測定大鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物[J].醫(yī)學臨床研究,2007,(1).
[5] 譚炳炎,鄭琳,馮翔.高效液相色譜/電化學法測定大鼠血液和腦組織中單胺類物質(zhì)的含量[J].分析測試學報,2006,(2).