李知新，劉光遠(yuǎn)，趙　燕，田進(jìn)梅，張學(xué)軍，張和平，吳　潤（.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州70070 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州70046；.寧夏動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川7500；）

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一致性檢驗(yàn)比較兩種弓形蟲抗體檢測試劑盒

李知新1,2,3，劉光遠(yuǎn)2*，趙燕3，田進(jìn)梅3，張學(xué)軍3，張和平3，吳潤1
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046；3.寧夏動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川750011；）

摘要：比較兩個弓形蟲抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果的一致性，為流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷篩選可合理使用的商品化試劑盒。對510份豬血清分別進(jìn)行弓形蟲抗體IHA和ELISA檢測，應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較兩種試劑盒檢測結(jié)果的一致性并進(jìn)行分析，用x2檢驗(yàn)分析差異性。兩種試劑盒聯(lián)合檢出79份陽性，陽性符合率為67.52％，陰性符合率為95.17％，總符合率為88.82％。x2檢驗(yàn)差異顯著（x2=228.23，p=0.00）；u檢驗(yàn)值為15.89，兩種產(chǎn)品的一致性為中度一致（Kappa值=0.66）。所以弓形蟲病IHA檢測試劑盒可作為現(xiàn)場收益流行病學(xué)調(diào)查，而弓形蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒適合輔助臨床檢測和診斷。x2檢驗(yàn)比較兩種試劑盒具有局限性。u檢驗(yàn)排除偶然性造成的一致程度，與Kappa檢驗(yàn)結(jié)合可比較一致性。弓形蟲抗體檢測要根據(jù)實(shí)況選擇不同的試劑盒。

關(guān)鍵詞：弓形蟲；Kappa檢驗(yàn)；x2檢驗(yàn)；u檢驗(yàn)；IHA；ELISA

弓形蟲（Toxoplasma）是一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生原蟲，可引起人獸共患寄生蟲病[1]。弓形蟲病缺乏特異性臨床癥狀和體征，臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多變，診斷較為困難，對其有效地診斷顯得尤為重要[2]。弓形蟲病檢測以免疫學(xué)為主，如間接血凝試驗(yàn)（IHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接熒光抗體試驗(yàn)（IFA）、膠乳凝集試驗(yàn)（LA）等[3]。目前市售商品化試劑盒種類較多，基層實(shí)驗(yàn)室常用IHA和ELISA方法診斷弓形蟲病。

Kappa一致性檢驗(yàn)在診斷試驗(yàn)中有兩種情況中：一種是評價(jià)待評價(jià)的診斷實(shí)驗(yàn)方法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性；另一種是評價(jià)兩種診斷方法對同一個樣本的診斷結(jié)果的一致性或兩個檢驗(yàn)工作者對同一種現(xiàn)象的診斷結(jié)論的一致性或同一檢驗(yàn)工作者對同一現(xiàn)象前后進(jìn)行兩次觀察做出的診斷的一致性[4-6]。應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較獸醫(yī)檢測試劑盒國外曾有報(bào)道。如Willems T等人利用兩種商品化的試劑盒，對口蹄疫病毒細(xì)胞增值活性進(jìn)行檢測，細(xì)胞增殖檢測試劑盒和細(xì)胞活性檢測試劑盒具有極強(qiáng)的一致性（u值=0.85，Kappa值=0.97）[7]；Chen T H等人用Kappa檢驗(yàn)比較了口蹄疫病毒液相芯片檢測法和3ABC多肽阻斷ELISA檢測法，兩種檢測方法的符合率為96.3％，Kappa檢驗(yàn)強(qiáng)度極強(qiáng)（Kappa值=0.92）[8]。國內(nèi)除劉華用Kappa檢驗(yàn)比較豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測試劑盒外[9]，未見其他報(bào)道。本試驗(yàn)用兩個商品化的弓形蟲檢測試劑盒開展弓形蟲抗體檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行了一致性檢驗(yàn)和分析，為選擇獸醫(yī)診斷試劑提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑

弓形體間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清批號：20131030，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和稀釋液批號：20130815），動物弓形蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒購自海泰生物制藥有限公司（批號：20131106）。

1.2豬血清

510份豬血清采自寧夏16個規(guī)模化養(yǎng)殖場和61個散養(yǎng)戶。

1.3方法

1.3.1檢測方法

1.3.1.1弓形蟲間接血凝試驗(yàn)按試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定時，陽性對照血清滴度不低于1∶1024；陰性對照血清除第1孔允許存在前滯現(xiàn)象“+”外，各孔均為“-”；稀釋液對照為“-”實(shí)驗(yàn)成立。被檢血清抗體滴度≥1∶64，“++”判為陽性。

1.3.1.2弓形蟲IgG抗體ELISA檢測將樣品和樣品稀釋液按1:100比例稀釋。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定時，陰性對照OD450nm≤0.20，臨界對照0.2＜0OD450nm＜0.60、陽性對照OD450nm＞0.60時，試驗(yàn)成立。被檢樣品OD450nm＞臨界對照OD450nm×1.1判為陽性；被檢樣品OD450nm＜臨界對照OD450nm×0.9判為陰性；介于二者之間判為可疑，需重新測定。

1.3.2Kappa系數(shù)的計(jì)算制作C×C列聯(lián)表，按照參考文獻(xiàn)[4-6]方法計(jì)算Kappa值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和參考判斷指標(biāo)

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對2種產(chǎn)品檢測的陽性率進(jìn)行x2檢驗(yàn)；u檢驗(yàn)按照參考文獻(xiàn)[4]計(jì)算，用來排除抽樣誤差的影響，在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下＜0.05在統(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為Kappa值并非由抽樣誤差所致，如果u值＜1.96，則＞0.05，則Kappa值大小沒有意義。一致性檢驗(yàn)進(jìn)行Kappa分析，當(dāng)K＜0，極差；0.0～0.2，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，高度；0.81～1.00，極強(qiáng)[10]。

2　結(jié)果

IHA試劑盒單獨(dú)檢出98份陽性，陽性率19.22％ （98/510），IgG抗體ELISA試劑盒單獨(dú)檢出117份陽性，陽性率22.94％（117/510），IgG抗體ELISA試劑盒檢測陽性略高于IHA試劑盒，經(jīng)x2檢驗(yàn)差異顯著（x2=228.232，p=0.00）。

兩種試劑盒聯(lián)合檢出79份陽性，陽性率符合率為67.52％（79/117），陰性符合率為95.17％（374/393），總符合率為88.82％（453/510）。為排除因抽樣誤差等偶然性導(dǎo)致兩種結(jié)果的一致性，進(jìn)行u檢驗(yàn)，經(jīng)檢測u檢驗(yàn)值為15.89，大于95％標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分位數(shù)1.96，Kappa一致性檢驗(yàn)值為0.66，表明兩種產(chǎn)品的一致性強(qiáng)度為中度。兩種試劑盒同時檢測510份血清結(jié)果見表1。

3　討論

Kappa一致性檢驗(yàn)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛[6,9-12]。在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究工作中，常遇到兩種檢測方法或兩名檢驗(yàn)人員的檢測結(jié)果是否一致以及用同一種方法進(jìn)行多次測定的結(jié)果能否重現(xiàn)的問題[6]。國內(nèi)在獸用疫病檢測試劑盒、實(shí)驗(yàn)室比對等方面應(yīng)用一致性檢驗(yàn)的方法對檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析報(bào)道不常見。

有關(guān)文獻(xiàn)中常見用符合率、x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和回歸系數(shù)等方法間接反映兩種結(jié)果的一致性，這些統(tǒng)計(jì)方法都存在局限性和不足[5]。在比較試劑盒之間的一致性時，x2檢驗(yàn)只能分辯兩者差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能反映兩者是否一致，甚至可能得出完全相反的結(jié)論，這與王潔貞等人的觀點(diǎn)一致[4]。而Kappa檢驗(yàn)不僅可用于一致性檢驗(yàn)，而且能給出一個反映一致性程度的值[5]。根據(jù)實(shí)際資料計(jì)算的K值只是一個樣本的統(tǒng)計(jì)量，存在著抽樣誤差，因而，所計(jì)算的K值是否來自K值為“0”的總體（即兩者之間的一致程度是由于機(jī)遇造成的），應(yīng)當(dāng)經(jīng)過假設(shè)檢驗(yàn)（u檢驗(yàn)）[6]。本試驗(yàn)u檢驗(yàn)值為15.89，大于95％標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分位數(shù)1.96，故P＜0.05，可以排除偶然性導(dǎo)致的兩種結(jié)果的一致，在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下可認(rèn)定兩種檢驗(yàn)方法具有一致性，且根據(jù)Kappa值為0.66這個判斷指標(biāo)，表明兩種產(chǎn)品的一致性強(qiáng)度為中度，說明這兩種試劑盒在血清學(xué)調(diào)查中差異不顯著，而x2檢驗(yàn)表明兩種試劑盒檢測差異顯著。

弓形蟲蟲體蛋白質(zhì)基因組復(fù)雜，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生的抗體也就不同。雖然重組抗原診斷弓形蟲病的特異性很高，但敏感性仍低于天然抗原，將多個重組抗原組合成“雞尾酒”式的診斷抗原或重組復(fù)合多表位診斷抗原等方法有望克服漏檢現(xiàn)象，提高診斷的準(zhǔn)確性[3]。但是弓形蟲病的IHA一般在病后1個月左右出現(xiàn)陽性[13，15]，因此，除人為因素外，與陽性出現(xiàn)的早晚有很大關(guān)系，而且IHA操作簡便，不需要特殊檢測儀器，因此認(rèn)為該方法更適用于現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，這與李冕、Patton S等人的觀點(diǎn)一致[2,13]。周海寧等人認(rèn)為弓形蟲間接血凝方法陽性檢出率低，結(jié)果判定與人為因素影響大有關(guān)，而弓形蟲IgG抗體ELISA方法客觀、敏感，省時、快捷，更適合于血清學(xué)調(diào)查[14]。由于該方法可出現(xiàn)假陽性，建議應(yīng)用于輔助臨床檢測和診斷，這與陳麗萍等人觀點(diǎn)一致[15]。因此，應(yīng)根據(jù)現(xiàn)有診斷資源合理選擇弓形蟲病的診斷方法，以適應(yīng)不同感染階段的診斷和不同目的的檢測。

表1　兩種試劑盒檢測結(jié)果比較

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通訊作者：劉光遠(yuǎn)*

作者簡介：李知新（1981-），男，寧夏隆德人，高級獸醫(yī)師，在讀獸醫(yī)博士，主要從事動物疾病預(yù)防與控制研究。

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)科技支撐項(xiàng)目（2013ZZN30）

中圖分類號：S855.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1006-799X(2016)12-0081-02