趙 彥 ，陳雪英 ，云錦鳳 ，劉湘萍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草品種育繁工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；3.草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）為冰草屬多年生叢生禾草，二倍體（2n=14），是我國(guó)干旱草原和荒漠地帶重要的禾本科牧草，產(chǎn)于我國(guó)北部沙漠以南邊緣地帶的干燥草原和沙地[1]。蒙古冰草具有抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐貧瘠等優(yōu)良特性，抗旱性尤其突出，根具沙套，是典型的旱生植物。蒙古冰草結(jié)實(shí)率、種子發(fā)芽率高，生命力強(qiáng)、適應(yīng)性廣，耐風(fēng)沙的侵襲，是良好的固沙植物，也是荒漠草原和干旱草原地帶退化草場(chǎng)補(bǔ)播的優(yōu)良草種[2-3]。但是，由于生態(tài)環(huán)境變化、過(guò)度放牧等原因草原退化，該物種在種群數(shù)量上逐漸減少，是國(guó)家二級(jí)珍稀瀕危植物和急需保護(hù)的農(nóng)作物野生近緣種[4]。目前，已從形態(tài)學(xué)[5-7]、細(xì)胞學(xué)[8-11]，分子生物學(xué)及生產(chǎn)利用[12-15]等不同層面對(duì)蒙古冰草進(jìn)行了研究。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)常用于植物育種、種質(zhì)資源的保存及其交換，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，逐漸成為了生物工程的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，并且廣泛應(yīng)用在遺傳、生化、生理、病理等研究上[16]。2004年霍秀文以蒙古冰草幼穗為外植體成功建立了再生體系，但幼穗作為外植體，取材時(shí)間上受季節(jié)限制，不能隨時(shí)供應(yīng)，存在一定的局限性[17-18]。因此，本試驗(yàn)試圖打破這一局限，以蒙古冰草無(wú)菌苗的不同部位為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，利用常用植物激素，探索適宜的濃度配比，建立一套有效的以莖尖為外植體的蒙古冰草組織培養(yǎng)再生體系，為進(jìn)一步的基因轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

蒙農(nóng)1號(hào)蒙古冰草種子，2014年采收于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗(yàn)站種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗培養(yǎng) 取蒙古冰草種子100粒，清水浸泡4～6 h，剝?nèi)?nèi)外稃，流水沖洗30 min，轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)操作，無(wú)菌水沖洗3～5遍，再用75%乙醇進(jìn)行表面消毒1 min，無(wú)菌水沖洗2～3次；用0.1%HgCl溶液處理7～10 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，接種于MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)無(wú)菌苗，每瓶接種20粒左右（圖1）。

1.2.2 外植體選擇 待無(wú)菌苗長(zhǎng)至5～8 cm時(shí)，將幼苗從莖尖到頂部分割成5段，每段3～5 mm，并按此順序編號(hào)為莖尖、莖段、葉片，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和質(zhì)量，篩選愈傷誘導(dǎo)率高的外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

1.3 培養(yǎng)基配置

以MS基本培養(yǎng)基為主，添加不同激素濃度的組合，其中蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH值調(diào)至5.8，在121℃條件下高壓滅菌20 min。

（1）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L）2，4-D+ （0，0.05，0.10，0.20 mg/L）6-BA。（2）繼代培養(yǎng)基 MS+1.5 mg/L 2，4-D。（3）分化培養(yǎng)基 MS+（2.0，3.0，4.0，5.0 mg/L）6-BA+（0.3，0.5，1.0 mg/L）NAA。（4）生根培養(yǎng)基 MS+0.5 mg/L NAA。

1.4 培養(yǎng)條件

愈傷組織誘導(dǎo)放入25℃的恒溫培養(yǎng)室，暗培養(yǎng)20 d后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2～3次，每隔21 d繼代培養(yǎng)1次。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，25℃光照培養(yǎng)，繼代1～2次，待分化出苗后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

出愈率=愈傷組織數(shù)量/外植體數(shù)量×100%

分化率=分化成苗數(shù)量/愈傷組織數(shù)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜外植體的篩選

蒙古冰草幼苗的莖尖、莖段、葉片作為外植體，接種到添加1.5 mg/L 2，4-D的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的出愈率，觀察愈傷狀態(tài)。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，愈傷誘導(dǎo)率由高到低依次為：莖尖、莖段、葉片（表1）。莖尖的誘導(dǎo)率明顯高于莖段，誘導(dǎo)率達(dá)到79.3%，愈傷組織質(zhì)量較好；莖段的誘導(dǎo)率僅為46.0%，愈傷組織小，質(zhì)量一般；葉片的愈傷誘導(dǎo)率僅為7.0%，且愈傷質(zhì)量較差。因此，莖尖為誘導(dǎo)愈傷組織的最適外植體。

2.2 不同激素濃度對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

以蒙古冰草莖尖作為外植體接種于不同激素水平的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表2）。2，4-D濃度設(shè)定5個(gè)梯度，分別為 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L；6-BA 濃度設(shè)定 4 個(gè)梯度，分別為 0，0.05，0.1，0.2 mg/L。

試驗(yàn)結(jié)果表明，MS+1.5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L6-BA培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到84.9%，并且愈傷狀態(tài)良好，為最適誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基。其中2，4-D對(duì)蒙古冰草莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，但濃度過(guò)高會(huì)抑制愈傷組織的產(chǎn)生，適量添加6-BA有助于提高愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷質(zhì)量。

表1 不同部位外植體的愈傷誘導(dǎo)結(jié)果

表2 不同激素濃度對(duì)蒙古冰草莖尖愈傷誘導(dǎo)的影響

2.3 誘導(dǎo)分化

繼代2次后，挑選緊實(shí)、顆粒狀的愈傷組織，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。結(jié)果表明，6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，分化率最高。添加適宜NAA可以提高愈傷組織的分化率，其中以6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基分化率最高，到達(dá)53.2%（圖2、表 3）。

表3 不同激素濃度組合條件下愈傷組織分化率

2.4 生根培養(yǎng)

待分化芽長(zhǎng)到4～6 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入MS+0.5 mg/L NAA生根培養(yǎng)基中（圖3），培養(yǎng)10 d左右，即可生根，生根率100%，每苗生根達(dá)到3條以上，根長(zhǎng)5 cm左右。在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d左右，即可移栽到花盆中。

2.5 移栽

再生植株需要室溫?zé)捗?～7 d，用自來(lái)水沖洗掉根部所帶的培養(yǎng)基，移栽到蛭石、沙土和營(yíng)養(yǎng)土（1∶1∶1）中，成活率在 90%以上。

3 結(jié)論與討論

對(duì)蒙古冰草組織培養(yǎng)及再生體系建立的研究較少，且外植體均為幼胚、幼穗、成熟胚等，但這些外植體或取材困難或受季節(jié)限制，尚未見(jiàn)到有關(guān)莖尖作為外植體獲得再生植株的報(bào)道。本試驗(yàn)以蒙古冰草幼苗的不同部位為外植體，探討了莖尖、莖段、葉片在生長(zhǎng)激素2，4-D和細(xì)胞分裂素6-BA調(diào)控下的愈傷誘導(dǎo)率。結(jié)果表明，莖尖為最適宜的外植體，再生性好。最適宜的2，4-D濃度為1.5 mg/L，而以幼穗、幼胚為外植體的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，2，4-D的濃度為2.0 mg/L[19-20]。

在禾本科牧草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)研究中，多以添加單一的生長(zhǎng)素2，4-D作為誘導(dǎo)因子。也有研究表明，添加細(xì)胞分裂素，如6-BA可以很好地改善愈傷狀態(tài)[20-21]。本試驗(yàn)也證實(shí)，當(dāng)添加0.1 mg/L 6-BA時(shí)，愈傷狀態(tài)明顯較不添加時(shí)好，但對(duì)誘導(dǎo)效果沒(méi)有明顯作用。當(dāng)2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率平均為64.0%，2，4-D濃度為1.5 mg/L時(shí)，愈傷組織平均誘導(dǎo)率為69.05%，隨2，4-D濃度增加，誘導(dǎo)率下降，愈傷組織質(zhì)量也受影響，呈較嚴(yán)重的水漬狀。可見(jiàn)，2，4-D濃度不宜過(guò)高，低濃度2，4-D有利于誘導(dǎo)蒙古冰草莖尖愈傷組織的形成，且愈傷組織質(zhì)量好。當(dāng)6-BA濃度為0 mg/L時(shí)，也可誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生，最高誘導(dǎo)率可達(dá)到77.4%，但愈傷組織質(zhì)量差，表面多為水漬狀，結(jié)構(gòu)松軟。當(dāng)添加0.1 mg/L 6-BA時(shí)，愈傷組織多為顆粒狀，緊實(shí)，愈傷狀態(tài)良好。

有研究表明，2，4-D是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚性發(fā)生的重要激素，細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)禾本科植物誘導(dǎo)愈傷組織分化的作用優(yōu)于其他分裂素[22]，分化過(guò)程中應(yīng)去掉2，4-D，添加生長(zhǎng)素NAA有利于植株分化，也可促進(jìn)再生苗生根[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，低濃度的NAA可提高愈傷組織的分化效率，促使再生苗健壯生長(zhǎng)，且容易生根，幼苗生根率高，移栽成活率高。本試驗(yàn)也證實(shí)NAA濃度不宜過(guò)高，當(dāng)NAA為1.0 mg/L時(shí)，抑制了愈傷組織的分化。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)蒙古冰草不同部位的離體培養(yǎng)，篩選出了莖尖為誘導(dǎo)愈傷的適宜外植體。這是首次建立蒙古冰草營(yíng)養(yǎng)體為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)；并通過(guò)MS添加不同激素配比試驗(yàn)，建立了一套以蒙古冰草莖尖為外植體的再生體系，其中最適愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+2，4-D 1.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L，最適分化培養(yǎng)基 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；生根培養(yǎng)基MS+NAA 0.5 mg/L。

參考文獻(xiàn)：

［1］郭本兆.中國(guó)植物志［M］.北京：科技出版社，1987.

［2］李立會(huì)，董玉琛.冰草屬研究進(jìn)展［J］.遺傳，1993，15（1）：45-48.

［3］張 眾，師文貴，逯曉萍.蒙古冰草研究概況［J］.草業(yè)科學(xué)，2004（7）：459-465.

［4］鄭殿升.中國(guó)農(nóng)業(yè)生物多樣性保護(hù)與可持續(xù)利用現(xiàn)狀調(diào)研報(bào)告［M］.北京：氣象出版社，2000.

［5］云錦鳳.冰草屬分類學(xué)研究的歷史回顧［J］.中國(guó)草地，1989（2）：3-7.

［6］云錦鳳，米福貴.干旱地區(qū)一種優(yōu)良禾草-蒙古冰草［J］.內(nèi)蒙古草業(yè)，1990（2）：70-71.

［7］云錦鳳，米福貴.冰草種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育及其開(kāi)花生物學(xué)［J］.中國(guó)草地，1989（4）：16-21.

［8］王榮華.滲透脅迫對(duì)蒙古冰草幼苗保護(hù)酶系統(tǒng)的影響［J］.植物學(xué)通報(bào)，2003，20（3）：330-335.

［9］云錦鳳，李瑞芬.冰草的遠(yuǎn)緣雜交及雜種分析［J］.草地學(xué)報(bào)，1997，5（4）：1-17.

［10］解新明，云錦鳳.蒙古冰草遺傳多樣性的RAPD分析［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2002（1）：56-62.

［11］李景欣，云錦鳳，阿拉坦蘇布道.冰草的遺傳多樣性研究［J］.中國(guó)草地，2004，26（6）：12-15.

［12］海 棠，云錦鳳，賈鮮艷，等.干旱地區(qū)優(yōu)良牧草引種種植試驗(yàn)的研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001（2）：41-43.

［13］谷安琳，云錦鳳，Larry Holzworth.冰草屬植物在內(nèi)蒙古干旱草原的種植試驗(yàn)［J］.中國(guó)草地，1994（3）：37-41.

［14］安 淵，王育清.沙地草場(chǎng)補(bǔ)播技術(shù)及其滲透效益研究［J］.草地學(xué)報(bào)，1997（1）：33-41.

［15］戚秋慧.內(nèi)蒙古典型草原禾本科牧草生態(tài)適應(yīng)綜合評(píng)價(jià)［J］.草地學(xué)報(bào)，1998（2）：133-138.

［16］張 童.禾本科植物離體再生體系研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新技術(shù)新產(chǎn)品，2009（1）：169.

［17］霍秀文.冰草組織培養(yǎng)再生體系建立及耐旱轉(zhuǎn)基因研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［18］張 輝.蒙農(nóng)雜種冰草成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生及轉(zhuǎn)基因研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［19］徐春波，米福貴，王 勇，等.影響冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生體系頻率的因素［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（1）：80-85.

［20］解繼紅，云錦鳳，楊 斌，等.2，4-D和BAP對(duì)蒙古冰草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2006，28（2）：44-47.

［21］王萬(wàn)軍，王文芳，曹建軍，等.小麥葉片愈傷組織及其再生植株的誘導(dǎo)［J］.西北植物學(xué)報(bào)，1998，18（3）：401-405.

［22］唐小艷，易自力，蔣建雄，等.高羊茅愈傷組織再生體系研究進(jìn)展［J］.四川草原，2006（5）：8-11.

［23］李小雷，于 卓，馬艷紅，等.加拿大披堿草×肥披堿草雜種F1幼穗組培再生體系的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（6）：2235-2237.